費(fèi)燕娜，高衛(wèi)東，王鴻博，王銀利

(1.生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實驗室(江南大學(xué))，江蘇無錫 214122;2.浙江朝暉過濾技術(shù)股份有限公司，浙江桐鄉(xiāng) 314500)

納米抗菌材料是在納米技術(shù)出現(xiàn)后，將抗菌劑通過一定的方法和技術(shù)制成納米級抗菌劑，再與抗菌載體通過一定的方法和技術(shù)制備而成的具有抗菌功能的材料。目前納米材料中，抗菌產(chǎn)品［1－3］及概念已成為其中最引人注目的應(yīng)用領(lǐng)域之一［4－6］。納米抗菌纖維作為納米材料中一個重要的方面，也受到越來越多研究人員的關(guān)注。目前制備納米級抗菌纖維最常見的方法是將諸如銀、氧化鋅、甲殼素、二氧化鈦等無機(jī)天然光催化型抗菌劑與高聚物共混，通過靜電紡絲法制備出具有抗菌功能的納米纖維，并對其抗菌性能以及抗菌機(jī)制進(jìn)行研究和探討［7－8］。王曦等［9］制備了含銀 PA6 納米纖維，分析了銀含量對抗菌效果的影響。XU等［10］制備了殼聚糖/聚乳酸復(fù)合納米纖維，研究了殼聚糖含量與抗菌效果之間的關(guān)系。茶多酚(TP)作為一種安全無毒副作用的綠色化合物，近年來已受到研究人員越來越多的關(guān)注［11－13］。本文將 TP作為抗菌劑，聚乳酸(PLA)作為載體，采用靜電紡絲法，制備PLA/TP復(fù)合納米纖維薄膜，分別采用抑菌圈法和振蕩燒瓶法對其進(jìn)行定性和定量的抗菌性能檢測，并對其抗菌機(jī)理進(jìn)行初步探討。

1 實驗部分

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料及試劑

茶多酚(TP)，純度98%，黃褐色粉末(江南大學(xué)食品學(xué)院);二氯甲烷(DCM)、N，N－二甲基甲酰胺(DMF)，分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);聚乳酸(PLA)切片，片材級，相對分子質(zhì)量為10萬(深圳光華實業(yè)偉業(yè)有限公司)。

抗菌主要化學(xué)試劑:牛肉浸膏、生化試劑BR、氯化鈉，氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 (中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);蛋白胨、瓊脂粉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2 靜電紡絲設(shè)備

WZ－50 C6型微量注射泵(浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，DW－P303－1ACD8 型高壓直流電源(天津東文高壓電源廠)，平板接收裝置(實驗室自制)。

1.2 實驗方法

1.2.1 紡絲液的制備

用電子天平稱取適量 PLA和 TP，溶于DCM、DMF的混合紡絲溶劑中。確定溶液中DCM和DMF的體積比為7∶3。本文實驗設(shè)定PLA與TP的質(zhì)量比 分 別 為:100/0、90/10、80/20、70/30、60/40、50/50(W/W)。在室溫下磁力攪拌12 h，靜置備用。

1.2.2 靜電紡絲

將上述紡絲液倒入20 mL注射器中，采用內(nèi)徑0.7 mm削平的注射針頭作為毛細(xì)管，調(diào)整注射器高度，使針頭高度與鋁箔接收板的中心位置在同一水平線上，二者之間的接收距離(C－SD)按需調(diào)節(jié)。注射泵連接高壓直流電源的正極，鋁箔接收板連接負(fù)極，溶液擠出量(紡絲速度)由注射泵控制可調(diào)，打開電源，按需要設(shè)定紡絲電壓。本文實驗中，紡絲工藝參數(shù)設(shè)定為:紡絲電壓18kV、紡絲速度0.6 mL/h、接收距離17 cm。

1.2.3 抗菌試樣制備

把待測試樣剪成直徑為25 mm的圓試樣(用于抑菌圈測試)及5 mm×5 mm小碎片(用于振蕩燒瓶法測試)若干，分別裝于三角錐形瓶內(nèi)封口，由于被測試樣不適宜高溫滅菌，因此本實驗采用紫外燈光照30 min滅菌備用。

1.3 紅外光譜(FT-IR)觀察

用衰減全反射(ATR－Ge)制樣法，將聚乳酸納米纖維膜和不同質(zhì)量混比的聚乳酸/茶多酚復(fù)合納米纖維膜分別制樣后進(jìn)行紅外光譜掃描，進(jìn)行比較分析。

1.4 抗菌性能測試

關(guān)于靜電紡納米薄膜的抗菌性能檢測，目前國內(nèi)尚無統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)。由于聚乳酸/茶多酚復(fù)合納米纖維膜為一次性紡織纖維用品，因此本文實驗參照紡織品抗菌性能的評價方法，分別采用抑菌圈法和改良的振蕩燒瓶法對PLA/TP復(fù)合納米纖維膜的抗菌性能進(jìn)行定性及定量的檢測。參照標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 20944.1—2007《瓊脂平皿擴(kuò)散法》、GB/T 20944.3—2008《振蕩法》以及 GB 15979—2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。實驗中所使用的2種菌種分別為:大腸桿菌(格蘭氏陰性菌代表，ATCC25922，E.coli);金黃色葡萄球菌(格蘭氏陽性菌代表，ATCC6538，S.aureus)。

1.4.1 抑菌圈法

在無菌培養(yǎng)皿中分別加入E.coli和S.aureus菌懸液，然后倒入冷卻至46℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，立即旋轉(zhuǎn)使其充分均勻分散，放置5 min待培養(yǎng)基凝結(jié)后，將直徑25 mm的試樣均勻的按壓在培養(yǎng)基中央，確保試樣和培養(yǎng)基充分接觸，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察試樣周圍的細(xì)菌生長情況，測量抑菌圈尺寸。

抑菌圈評價:根據(jù)抑菌圈寬度以及試樣下方細(xì)菌的繁殖情況來判定抑菌效果的好壞。每個試樣至少測量3處，取平均值。抑菌圈大小可按式(1)計算:

式中:H為抑菌圈寬度，D為抑菌圈外徑的平均值，d為試樣直徑，單位均為cm。

1.4.2 振蕩燒瓶法

將試樣放入加有菌液的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，進(jìn)行“0”接觸時刻取樣，按10倍稀釋法制作平皿，待瓊脂冷卻后放入37℃培養(yǎng)箱中，然后將裝有試樣和菌液的燒瓶放入搖瓶柜中，溫度設(shè)定為37℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，到規(guī)定時間后，取出燒瓶，按“0”接觸時刻平皿的制作方法制作平皿，冷卻后放入相同培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

抗菌效果評價:樣品的抗菌性能通過抑菌率進(jìn)行判定，可按式(2)計算:

式中:XS為抑菌率;A為“0”接觸時刻平均菌落數(shù);B為樣品振蕩后平均菌落數(shù)。

1.5 抗菌機(jī)理

為探討TP的抗菌機(jī)制，采用H－7000型透射電鏡(日本HITACHI公司)分析經(jīng)過PLA/TP復(fù)合納米纖維膜處理后的菌體，觀察TP加入對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 FT-IR分析

圖1示出不同混比條件下PLA/TP復(fù)合納米纖維膜的紅外光譜圖。

圖1 PLA/TP復(fù)合納米纖維膜FT－IR圖Fig.1 IR spectra of PLA/TP composed nanofibermembranes

通過分析圖1可得出以下2點(diǎn)結(jié)論:1)當(dāng)PLA與TP混比為100/0時，紅外譜圖中在1 381 cm－1處出現(xiàn)甲基的變形振動吸收峰，但隨著TP含量的增加，當(dāng)混比為 80/20時，這個吸收峰已右移至1 359 cm－1處，當(dāng)TP含量繼續(xù)增加至二者比例為50/50時，已右移至1 339 cm－1處，這是由于PLA中的甲基結(jié)合TP中的苯環(huán)形成π－π共軛體系，由于共軛效應(yīng)，使其電子云密度平均化，因此使吸收峰向低波數(shù)方向移動，同時由于受到氫鍵的影響，峰形有變寬的趨勢;2)隨著PLA/TP中TP含量的增加，PLA中出現(xiàn)苯環(huán)取代現(xiàn)象，當(dāng)二者混比達(dá)到70/30時，從紅外譜圖可以很明顯地看出在1 613 cm－1處出現(xiàn)苯環(huán)吸收峰，當(dāng)TP含量繼續(xù)增加，吸收峰也隨之增強(qiáng)，可以看到在60/40、50/50的紅外譜圖中分別在1 611 cm－1和1 558 cm－1處出現(xiàn)苯環(huán)吸收峰，同時在821 cm－1處出現(xiàn)了取代苯的特征吸收峰。綜上可知:以PLA為載體，TP為抗菌劑共混紡制的PLA/TP復(fù)合納米纖維薄膜中二者通過價鍵的結(jié)合很好地復(fù)合在一起。

2.2 復(fù)合膜的抑菌性

圖2(a)、(b)、(c)分別示出不同質(zhì)量比條件下PLA/TP復(fù)合納米纖維膜對E.coli的抑菌效果。圖2(d)、(e)、(f)分別示出各試樣對S.aureus的抑菌效果圖。從圖2(a)、(d)中可以明顯看到?jīng)]有添加TP的純PLA納米纖維膜沒有抑菌圈，且試樣下方細(xì)菌的繁殖情況僅是輕微減少，因此可以判定純PLA納米纖維膜對E.coli和S.aureus沒有抗菌效果。當(dāng)二者質(zhì)量比為90/10時(見圖2(b)、(e))，可以看出試樣周圍仍然沒有抑菌圈，但試樣下方細(xì)菌繁殖情況明顯被抑制，僅有少量菌落，因此可以認(rèn)為該試樣對2種菌的抗菌效果較好。當(dāng)二者質(zhì)量比為80/20時，從圖2(c)、(f)中可以看出試樣周圍開始出現(xiàn)抑菌圈，且試樣下方?jīng)]有細(xì)菌繁殖，對2種菌的抗菌效果好。繼續(xù)增加TP含量，發(fā)現(xiàn)除抑菌圈寬度稍有增加外，其余效果與圖2(c)、(f)相似。

表1示出不同質(zhì)量比PLA/TP復(fù)合納米纖維膜抑菌寬度，從表可以看出，隨著復(fù)合薄膜中TP含量的增加，抑菌圈寬度也逐漸增加，抗菌效果增強(qiáng)。當(dāng)PLA與 TP的質(zhì)量比為 50/50時，對E.coli和S.aureus的抑菌圈寬度分別達(dá)到5.17 cm和5.67 cm。并且對S.aureus的抑菌圈寬度要稍大于大腸桿菌的抑菌圈寬度，說明復(fù)合薄膜對S.aureus的抗菌效果強(qiáng)于E.coli。

表1 不同質(zhì)量比PLA/TP復(fù)合納米纖維膜抑菌寬度Tab.1 W idths of inhibition zones of PLA/TP com posed membranesw ith differentmass ratios cm

2.3 振蕩燒瓶法分析

圖2 不同質(zhì)量比PLA/TP復(fù)合納米纖維膜抑菌圈實驗效果Fig.2 Results of inhibition zone tests of PLA/TP composed membranes with differentmass ratios

表2示出不同質(zhì)量HPLA/TP復(fù)合納米纖維膜抑菌率。從表可看出，隨著PLA與TP質(zhì)量比從100/0減小到90/10時，抑菌率明顯提高。對E.coli和S.aureus的抑菌率分別從20.6%和21.3%迅速上升到92.9%和85.7%，當(dāng)PLA與TP質(zhì)量比繼續(xù)減小到50/50時，復(fù)合納米纖維膜的抑菌率上升趨勢逐漸變緩，對E.coli和S.aureus的抑菌率分別達(dá)到96.9%和97.6%。說明不加TP的PLA納米纖維膜的抗菌效果不明顯。當(dāng)PLA與TP質(zhì)量比為90/10時，復(fù)合納米纖維膜的抗菌性能已得到顯著提高，若再增加TP含量，對抗菌性能的改善已不太明顯。各試樣對S.aureus的抑菌率要稍大于E.coli的抑菌率，與抑菌圈實驗結(jié)果一致。

圖3示出不同質(zhì)量HPLA/TP復(fù)合納米纖維抗菌效果。從圖可看出，加了PLA/TP復(fù)合納米纖維膜后，平皿中的菌落數(shù)較之不加試樣的有明顯減少，隨著TP含量的增加，菌落數(shù)迅速減少，當(dāng)PLA與TP質(zhì)量比從70/30減小到50/50時，從拍攝的圖片中憑肉眼均已很難觀察到菌落。

2.4 復(fù)合膜的形貌分析

圖3 不同質(zhì)量比PLA/TP復(fù)合納米纖維膜抗菌效果Fig.3 Antibacterial results of PLA/TP composed membranes with differentmass ratios

表2 不同質(zhì)量比PLA/TP復(fù)合納米纖維膜抑菌率Tab.2 Antibacterial rate of PLA/TP com posed film s w ith differentmass ratios %

為了進(jìn)一步探討PLA/TP復(fù)合納米纖維膜的抑菌機(jī)理，采用透射電鏡分析處理前后S.aureus和E.coli超微結(jié)構(gòu)的變化。圖4示出不同薄膜處理前后菌體的TEM照片。從圖中可以看出未經(jīng)纖維膜處理的S.aureus和E.coli，呈清晰的球狀結(jié)構(gòu)和桿狀結(jié)構(gòu)，菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜連續(xù)完整，表面平滑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，沒有損傷(圖4(a)、(d))。2種菌經(jīng)PLA納米纖維膜處理后，雖然細(xì)胞結(jié)構(gòu)開始模糊，但細(xì)胞壁、膜沒有損傷(圖4(b)、(e))。明顯觀察到經(jīng)PLA/TP(50/50)復(fù)合納米纖維膜處理后，細(xì)胞質(zhì)膜開始破裂(圖4(c)、(f))，并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理過后的S.aureus細(xì)胞膜破裂程度嚴(yán)重，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄，見圖4(c)。由此可以推斷PLA/TP復(fù)合納米纖維膜破壞了2種菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，內(nèi)容物呈絮狀流出，細(xì)胞質(zhì)成碎渣樣或呈彌散狀，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時可以看出添加TP的復(fù)合納米薄膜對S.aureus細(xì)胞膜的破壞作用要強(qiáng)于E.coli，作用相同時間后，TEM照片顯示E.coli的細(xì)胞膜開始出現(xiàn)大量裂痕，而S.aureus的細(xì)胞膜已基本完全破裂，內(nèi)容物流出。因此在相同作用時間內(nèi)，PLA/TP復(fù)合納米纖維薄膜對S.aureus的抗菌效果要優(yōu)于E.coli。

圖4 不同薄膜處理前后菌體的TEM照片F(xiàn)ig.4 TEM images of bacterial before and after treated by differentmembranes.(a)，(b)，(c):S.aureus before and after treated by PLA membrane and PLA/TP composed membranes;(d)，(e)，(f):E.coli before and after treated by PLA membrane and PLA/TP composed membrane

3 結(jié)論

1)FT－IR分析確定聚乳酸/茶多酚復(fù)合納米纖維膜中有茶多酚的存在。二者通過價鍵的結(jié)合很好地復(fù)合在一起。

2)PLA/TP復(fù)合納米纖維膜抗菌測試結(jié)果均表明:未添加TP的PLA納米纖維膜基本沒有抗菌效果，但隨著TP含量的增加，抗菌性能提高。并且復(fù)合納米纖維膜對金黃色葡萄球菌的抗菌效果要優(yōu)于大腸桿菌。抑菌圈實驗結(jié)果表明:隨著復(fù)合薄膜中TP含量的增加，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌寬度分別從3.67和3.71 cm增加到5.17和5.67 cm。振蕩燒瓶實驗結(jié)果表明:少量TP的加入，可使得PLA/TP復(fù)合納米纖維膜的抗菌性能得到顯著提高，若持續(xù)增加TP含量，對抗菌性能的改善不太明顯。

3)TEM照片從微觀上揭示了PLA/TP復(fù)合納米纖維膜對2種菌種細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞作用。同時也揭示了該復(fù)合納米纖維薄膜對金黃色葡萄球菌膜結(jié)構(gòu)完整性的破壞作用要強(qiáng)于大腸桿菌。

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