，，

(1.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內科，遼寧 大連 116027；2.大連市中心醫(yī)院 神經(jīng)內科，遼寧 大連 116033)

基礎醫(yī)學

腦組織缺血耐受性與凋亡相關基因NF-κB和caspase-3的表達研究

馬春野1，王茂湘2，尹琳1

(1.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內科，遼寧 大連 116027；2.大連市中心醫(yī)院 神經(jīng)內科，遼寧 大連 116033)

目的探討腦缺血預處理引起的腦保護機制，為臨床缺血性腦血管病的防治提供理論依據(jù)。方法48只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重200～250 g)隨機分成3組：假手術組(n=16)、腦缺血預處理組(n=16)、腦缺血組(n=16)。假手術組：頸部正中切口暴露右側頸總動脈后縫合皮膚。腦缺血預處理組：按Koizumi線栓法改良制成局灶-局灶腦缺血模型，先阻斷大腦中動脈血流30 min后恢復血流，再灌注24 h，之后再阻斷同側大腦中動脈血流24 h。腦缺血組：阻斷大腦中動脈血流24 h。分別觀察3組動物的以下指標：按Bederson法進行神經(jīng)功能評分；以干濕重法計算腦含水量，腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重；用免疫組織化學方法檢測大鼠海馬組織NF-κB和caspase-3的表達。結果(1)神經(jīng)功能評分：假手術組、預處理組和腦缺血組分別為0分、(1.13±0.99)分和(2.25±0.89)分。各組間比較差異明顯(P<0.05)。(2)腦含水量測定：假手術組、預處理組和腦缺血組分別為(69.9±0.38)%、(75.5±0.54)%和(81.9±0.55)%，各組間比較差異明顯(P<0.05)。(3)基因表達檢測(個/高倍視野)：假手術組、預處理組和腦缺血組NF-κB表達分別為11.2±2.59、25.4±3.78和38.6±7.67；假手術組、預處理組和腦缺血組caspase-3表達分別為0.8±0.84、27.2±3.42和37.8±4.49。預處理組NF-κB和caspase-3的表達均低于腦缺血組，而高于假手術組，各組間比較差異有顯著性意義(P<0.05)。結論腦缺血預處理后對再次缺血有保護作用，凋亡相關基因NF-κB和caspase-3表達的減少在這種腦保護機制中可能起重要作用。

腦組織缺血耐受；凋亡；NF-κB；caspase-3

短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attacks，TIA)是指腦血管病變引起的短暫性/局限性腦功能缺失或視網(wǎng)膜功能障礙。臨床癥狀一般持續(xù)10～20 min，多在1 h內緩解，最長不超過24 h，不遺留神經(jīng)功能缺損癥狀，結構性影像(CT、MRI)檢查無責任病灶。近年來的研究表明，實驗性亞致死性全腦缺血和局灶性腦缺血均可誘發(fā)對隨后發(fā)生的致死性全腦缺血或局灶性腦缺血所致的神經(jīng)元損傷的保護性作用。腦缺血預處理誘導腦組織對隨后的缺血性損傷產(chǎn)生遲發(fā)性抵抗能力的現(xiàn)象稱腦組織缺血耐受(ischemic tolerance，IT)。但目前腦組織缺血耐受發(fā)生機制仍不十分清楚，有研究表明，腦缺血預處理后通過許多細胞內信號轉導途徑最終導致腦組織缺血耐受的發(fā)生。近年來，凋亡相關基因的表達與腦組織缺血耐受的關系受到人們的關注，包括核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和半胱天冬酶-3(caspase-3)，它們均在凋亡細胞中有較多表達。本研究通過建立類似于臨床TIA的局灶-局灶缺血動物模型，即腦組織缺血耐受模型及腦缺血模型來探討腦組織缺血耐受現(xiàn)象，并觀察凋亡相關基因NF-κB和caspase-3在腦組織缺血耐受中的表達，進一步探討腦組織缺血耐受的發(fā)生機制，為臨床缺血性腦血管病的預防和治療提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 研究對象

健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體重200～250 g(大連醫(yī)科大學動物中心提供)。

隨機分為假手術組(n=16)、腦缺血預處理組(n=16)和腦缺血組(n=16)。

1.2 模型制作

直徑0.205 mm高彈力碳素魚線，剪成6 cm長的線段，插線頭蘸蠟成圓頭，臨用時蘸取肝素，制成線栓。按Koizumi線栓方法[1]及焦卓敏局灶缺血模型[2]，略加改良。

假手術組(n=16)：頸部正中切口，暴露右側頸總動脈，縫合皮膚。

腦缺血預處理組(n=16)：大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉大鼠仰臥固定于手術木板上，頸部正中切口，從兩側頜下腺之間剪開淺筋膜，顯露右側胸鎖乳突肌。鈍性分離右側胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌間的肌間隙，暴露右頸總動脈(CCA)，分離右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)。結扎并離斷右頸外動脈遠端，在右頸內動脈近顱端及右頸總動脈近心端下微動脈夾，在右頸外動脈近心側殘端剪一小口，經(jīng)此小口插入備好的線栓，經(jīng)右頸內動脈(松開此處動脈夾)入顱，至右大腦前動脈以阻斷右大腦中動脈的血流。線栓平均插入深度為(18.5±0.5)mm，此時剪口處不滲血。缺血30 min(3次10 min間隔7 min)，此過程中用生理鹽水紗布覆蓋手術部位，以防干燥及污染，拔出線栓，結扎右頸外動脈近心側殘端，松開右頸總動脈處微動脈夾，縫合皮膚，酒精消毒。飼養(yǎng)24 h后在右側頸總動脈剪一小口，經(jīng)右頸內動脈再栓至右側大腦中動脈，再缺血時間為24 h。

腦缺血組(n=16)：直接從右頸總動脈進線栓至右側大腦中動脈，缺血時間為24 h。模型成功的標志是動物蘇醒后出現(xiàn)同側Horner征(眼裂變小，眼球內陷)和對側以前臂為重的偏癱。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經(jīng)功能評價：每組8只。按Bederson 法進行神經(jīng)功能評價[3]。0分為無神經(jīng)功能缺損；1分為患側腕、肘關節(jié)屈曲，肩內收屈曲；2分為上述體征，并向麻痹側推阻力下降；3分為活動時向麻痹側轉圈。假手術組縫合皮膚后24 h進行神經(jīng)功能評分。腦缺血預處理組在再次缺血24 h后進行神經(jīng)功能評價，腦缺血組在缺血24 h后進行神經(jīng)功能評價。

1.3.2 腦含水量測定：每組8只。按干重濕重法[4]進行測定。神經(jīng)功能評價后的大鼠用大劑量10%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭取腦，用托盤式扭力天秤迅速測濕重，再置于100 ℃電熱干燥箱24 h后測干重。腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重。計算各組動物腦含水量。

1.3.3 基因表達檢測：每組8只。假手術組、腦缺血預處理組及腦缺血組每組其余8只大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，斷頭取腦，取海馬區(qū)組織外固定，石蠟包埋切片，切片厚度5 mm, 切片貼附于經(jīng)APES處理的載玻片上,用免疫組織化學方法(相鄰腦組織進行常規(guī)HE染色,并觀察病理神經(jīng)元)，切片以二甲苯脫蠟及系列酒精入水，流水沖洗10 min，0.01 mmol/L PBS洗2×3 min，H2O2室溫孵育切片15 min，PBS洗2×3 min，微波爐抗原修復15 min，自然冷卻后，PBS洗2×3 min，加動物血清封閉劑，室溫15 min，傾去封閉劑，加入稀釋液配制的第一抗體工作液，4 ℃冰箱濕盒中過夜(18 h以上)，PBS洗3×3 min，加生物素化二抗工作液，37 ℃濕盒中溫育15 min，PBS洗3×3 min，加鏈親素酶標，37 ℃濕盒中溫育15 min，PBS洗3×3 min，DAB顯色，鏡下控制，顯色完成后入水終止顯色，流水沖洗10 min，蘇木素復染，流水返藍，系列酒精二甲苯脫水透明，中性樹膠封片。判斷標準：顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性細胞，鏡下胞質或胞核有棕黃色顆粒者為陽性細胞，無棕黃色顆粒者為陰性結果。每張免疫組化切片中采集10個具有代表性的高倍視野，計算NF-κB和caspase-3陽性細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 神經(jīng)功能評分

假手術組8只大鼠均為0分，腦缺血預處理組8只大鼠平均為(1.13±0.99)分，腦缺血組8只大鼠平均為(2.25±0.89)分。3組組間比較差異有顯著性意義(P<0.05)。

2.2 腦含水量測定

假手術組(69.9±0.38)%,腦缺血預處理組(75.5±0.54)%，腦缺血組(81.9±0.55)%，3組組間比較差異有顯著性意義(P<0.05)。

2.3 神經(jīng)元的病理變化

HE染色光學顯微鏡下觀察，正常神經(jīng)元核圓形，邊界及核仁清楚(圖1)；損傷神經(jīng)元胞核腫大，偏位，核仁消失，胞漿著色淺、蒼白或核濃縮、深染，細胞呈三角形缺血性壞死變化(圖2)。腦缺血預處理組及腦缺血組在海馬區(qū)均可見正常神經(jīng)元和損傷神經(jīng)元。取10個高倍視野，分別計算假手術組、腦缺血預處理組及腦缺血組損傷神經(jīng)元數(shù)量，分別為(2.6±0.55)個/HP，(70.2±13.83)個/HP，(88.2±8.70)個/HP，3組組間比較差異有顯著性意義(P<0.05)。

圖1 正常神經(jīng)元(×400)

圖2 異常神經(jīng)元(×400)

2.4 NF-κB和caspase-3檢測

假手術組、腦缺血預處理組和腦缺血組表達NF-κB的神經(jīng)細胞數(shù)分別為(11.2±2.59)個/HP、(25.4±3.78)個/HP和(38.6±7.67)個/HP(圖3)；假手術組、腦缺血預處理組和腦缺血組表達caspase-3的神經(jīng)細胞數(shù)分別為(0.8±0.84)個/HP、(27.2±3.42)個/HP和(37.8±4.49)個/HP(圖4)。腦缺血預處理組NF-κB和caspase-3的表達低于腦缺血組，高于假手術組，各組間比較差異有顯著性意義(P<0.05)。

圖3 海馬區(qū)NF-κB陽性神經(jīng)元(×400)

圖4 海馬區(qū)caspase-3陽性神經(jīng)元(×400)

3 討 論

腦缺血預處理是指對腦預先進行短暫的亞致死性缺血處理，從而使腦在隨后發(fā)生的致死性缺血中得到保護，這一保護效應稱為腦組織缺血耐受效應。盡管國內外對腦組織缺血耐受現(xiàn)象進行了較多的研究，但到目前為止，腦組織缺血耐受的確切機制仍不十分清楚，可能包括興奮性氨基酸濃度的增加，腺苷的釋放，新的基因產(chǎn)物的形成，膠質細胞的生成，凋亡和凋亡抑制物基因產(chǎn)物的表達[5]等多個環(huán)節(jié)。目前已知腦缺血后神經(jīng)元有凋亡發(fā)生，但其確切機制仍不清楚。各種研究表明凋亡受一系列基因表達的調控，腦缺血損傷后,許多基因轉錄、翻譯，編碼合成的蛋白質產(chǎn)物直接或間接參與了腦缺血后神經(jīng)元的凋亡過程。在參與調控神經(jīng)元凋亡的基因和蛋白質產(chǎn)物中， NF-κB和caspase-3備受關注。

NF-κB屬于Rel蛋白家族，細胞在靜息狀態(tài)時，NF-κB 以無活性的形式存在于胞漿，只有NF-κB被激活以后，才從胞漿轉位至胞核而發(fā)揮作用。NF-κB是一個重要的核轉錄調控因子，在機體生理和病理條件下發(fā)揮重要的作用。生理情況下，腦組織中NF-κB 呈低表達、低活化和低活性的“三低”狀態(tài)。當受到某些刺激時，通過特定的蛋白激酶，使NF-κB抑制蛋白(inhibitor κB，IκB)磷酸化后降解，NF-κB才得以從胞漿中的三聚體釋出，并迅速進入胞核內，與NF-κB靶基因的同源序列位點結合，使這些靶基因表達增加，從而產(chǎn)生不同的基因產(chǎn)物，進一步參與體內的炎癥反應和免疫反應。Clemens等[6]發(fā)現(xiàn)大鼠全腦缺血30 min后，再灌注24 h和72 h ，NF-κB明顯活化。馮春生等[7]觀察到大鼠腦局灶缺血2 h，再灌注3 h、6 h和24 h，免疫組化均見NF-κB明顯從細胞漿移位于細胞核；再灌注6 h、12 h和24 h，Western-blot法檢測到NF-κB的表達量顯著增加。目前對NF-κB在腦缺血損傷中的作用有兩種不同的觀點，一種認為NF-κB在腦缺血損傷中起破壞作用。Schneider等[8]在大鼠體內實驗中證實，腦缺血能夠引起NF-κB的活化，細胞核內的NF-κB易位增加，而p50基因敲除的大鼠腦缺血損傷較正常鼠明顯減輕，認為NF-κB活性增高可促進細胞死亡。NF-κB與炎癥反應密切相關, 多種炎癥介質基因的啟動子和增強子中存在一個或多個κB序列, 如IL-1、IL-8、IL-6、TNF-α、血管細胞間粘附分子-1(VCAM-1)和細胞間粘附分子-1(ICAM-1), 活化的NF-κB可單獨或與其他轉錄因子協(xié)同參與上述介質基因的誘導表達[9-10]。陳燕啟等[11]發(fā)現(xiàn)，在夾閉大鼠雙側頸總動脈10 min，全腦缺血再灌注2 h后NF-κB即有表達，6 h達高峰，且其表達與存活神經(jīng)數(shù)目呈顯著負相關，并發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注激活了NF-κB，活化的NF-κB可上調IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 的表達，促進腦缺血再灌注炎性損傷反應發(fā)生。另一種觀點認為NF-κB在腦缺血損傷中起保護作用。體外神經(jīng)細胞培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，缺血可引起NF-κB的p65亞基缺失，增加了神經(jīng)細胞對TNF-α細胞毒性的敏感性，而激活NF-κB可以促進抗細胞凋亡基因產(chǎn)物的表達，從而起到保護作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血預處理的神經(jīng)保護效應依賴于NF-κB的激活,可能通過上調B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達,同時抑制缺血再灌注中NF-κB的活性而減少ICAM-1的產(chǎn)生發(fā)揮作用[13]。Nicolas B等[14]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血預處理阻滯NF-κB的激活，也抑制了腦缺血預處理的神經(jīng)保護作用，從而說明NF-κB的激活是腦組織缺血耐受產(chǎn)生所必須的。目前已證實NF-κB的作用具有二重性，當它被細胞外刺激信號激活后，一方面可以促進一系列炎癥細胞因子的產(chǎn)生，引起機體炎癥反應；另一方面還可以介導細胞保護性基因(包括抗凋亡、抑制炎癥反應的基因等)的表達[15]。

Caspase-3屬于白介素1β轉換酶(inter-leukin-1βconverting enzyme，ICE)家族，是涉及細胞凋亡的蛋白酶。生理情況下，caspase-3以無活性的caspase-3酶原(pro-caspase-3)形式存在于哺乳動物的多種組織和細胞內。細胞凋亡是由各種凋亡刺激信號始動，受細胞內源性基因、酶類和信號傳導

途徑等調控的“瀑布式”激活過程。其中,蛋白酶與細胞凋亡密切相關。Caspase-3是凋亡的重要執(zhí)行者,也是哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶。在蛋白酶級聯(lián)切割過程中，caspase-3處于核心位置，不同的蛋白酶分別切割caspase-3酶原，從而激活caspase-3?；罨腸aspase-3又進一步切割不同的底物，導致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細胞走向死亡[16]。因此，caspase-3被稱為死亡蛋白酶。在正常人腦神經(jīng)元細胞中幾乎無caspase-3免疫反應，而在人腦嚴重缺血時，caspase-3蛋白表達明顯升高[17]。大鼠大腦中動脈梗塞后，損傷同側皮質caspase-3 mRNA的表達在6 h、12 h和24 h顯著增高，提示這種增高具有梗死依賴性[18]。在caspase-3基因缺失小鼠缺血2 h再灌注48 h后，皮質梗死面積縮小55%，TUNEL陽性細胞數(shù)減少36%，提示caspase-3激活在缺血神經(jīng)元凋亡的發(fā)生中起重要作用[19]。

曲喜英等[20]發(fā)現(xiàn)細胞凋亡時可能通過激活NF-κB,繼而激活caspase-3, 最終導致細胞凋亡。另一研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的抗凋亡作用與減弱caspase家族的功能有關[21-22]。本實驗是建立局灶-局灶腦缺血耐受模型，通過神經(jīng)功能評分、腦含水量的測定，發(fā)現(xiàn)腦缺血預處理能誘導缺血耐受的產(chǎn)生，對再次致死性的腦缺血有神經(jīng)保護作用；同時也發(fā)現(xiàn)凋亡相關基因NF-κB和caspase-3的表達在腦缺血預處理組中均低于腦缺血組，而高于假手術組，提示細胞凋亡可能與激活NF-κB，繼而激活caspase-3有關，而激活的NF-κB則可能對再次缺血激活NF-κB有抑制作用，從而使再次缺血時NF-κB和caspase-3的表達減少，起到神經(jīng)保護作用，與田代實等[13]發(fā)現(xiàn)的缺血預處理過程中NF-κB的激活可能導致細胞內某些靶基因表達發(fā)生改變,從而抑制了缺血再灌注中NF-κB活性的研究結果基本相同。

總之，凋亡相關基因可能參與腦組織缺血耐受的調控，但其具體的作用機制仍需進一步研究。如果能從基因水平控制凋亡過程，將為缺血性腦血管病的防治提供新的途徑。隨著對神經(jīng)元凋亡相關基因研究的深入及凋亡機制的闡明，基因表達的干預將成為腦卒中治療進展中最有潛力、具有突破性的治療手段。

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StudyonthetolerancetocerebralischemiaandtheexpressionofNF-κBandcaspase-3

MAChun-ye1,WANGMao-xiang2,YINLin1

(1.DepartmentofNeurology，theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116027，China; 2.DepartmentofNeurology，DalianMunicipalCentralHospital，Dalian116033，China)

ObjectiveTo investigate the brain protecting mechanism produced by ischemia preconditioning.MethodsForty-eight healthy male Sprague-Dawley (SD) rats (weight 200-250 g) were randomly divided into 3 groups: false operation group (n=16), ischemia preconditioning group (n=16), and ischemia group (n=16). False operation group: sewing up the skin after exposing the common carotid artery (CCA) in the right side. Ischemia preconditioning group: a focal-focal cerebral ischemic model, adopting the thread embolism method according to Koizumi. Occluding middle cerebral artery(MCA) blood flow for 30 minutes, then reperfusing for 24 hours, after that, occluding MCA again for 24 hours. Ischemia group: occluding MCA directly for 24 hours. The following indexes in 3 groups were observed respectively: neurological function (according to Bederson method); the water content of brain (wet weight and dry weight method), and the expression of NF-κB and caspase-3 in hippocampal tissue of rats (immunohistochemistry method).Results(1) The

nerve functional scoring: false operation group, ischemia preconditioning group and ischemia group is respectively 0 point,(1.13±0.99) points and (2.25±0.89) points, the difference was significant (P<0.05). (2)The water content of brain: false operation group, ischemia preconditioning group and ischemia group is respectively (69.9±0.38)%, (75.5±0.54)% and (81.9±0.55)%，the difference was significant(P<0.05).(3)Detection of gene expression(unit:number/high power field):the NF-κB expression in false operation group, ischemia preconditioning group and ischemia group is respectively 11.2±2.59，25.4±3.78 and 38.6±7.67；the caspase-3 expression in false operation group, ischemia preconditioning group and ischemia group is respectively 0.8±0.84，27.2±3.42 and 37.8±4.49. The expressions of NF-κB and caspase-3 in ischemia preconditioning group were lower than those in ischemia group, but higher than those in false operation group, the difference was significant(P<0.05).ConclusionIschemia preconditioning could increase the tolerance obviously to severe ischemia injury later. The decreasing expression of genes related to apoptosis such as NF-κB and caspase-3 might play an important role in this protecting mechanism of brain.

cerebral ischemia tolerance; apoptosis; NF-κB; caspase-3

10.11724/jdmu.2013.04.06

R743.32

A

1671-7295(2013)04-0330-06

馬春野，王茂湘，尹琳. 腦組織缺血耐受性與凋亡相關基因NF-κB和caspase-3的表達研究[J].大連醫(yī)科大學學報，2013,35(4)：330-335.

馬春野(1977-)，男，遼寧大連人，主治醫(yī)師。E-mail：machunye2008@163.com

尹 琳，教授。E-mail：andreas2005@vip.sina.com

2013-06-15；

2013-06-20)