劉效瑞，楊 寧，王春明，尚虎山，汪淑霞，王興政

（1.甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心，甘肅 定西 743000；2.西北師范大學(xué)，甘肅 蘭州730070）

我國中藥材資源豐富，是世界藥材的主產(chǎn)國，對(duì)中藥材的研究有幾千年的歷史。甘肅省自然條件雖然惡劣，但卻是中藥材生長的適宜地帶，中藥材生產(chǎn)在全國具有明顯的競爭優(yōu)勢，為全國中藥材優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)和生產(chǎn)大省，其中黃芪栽培面積和產(chǎn)量約占全國的50%左右。黃芪（Radix Astragali）又名黃耆，為植物和中藥材的統(tǒng)稱。植物黃芪產(chǎn)于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江等地，為國家三級(jí)保護(hù)植物。黃芪是臨床常用中藥材，其化學(xué)成分眾多，主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類等有效成分。黃芪來源于豆科植物膜莢黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge］和蒙古黃芪［Astragalus membranaceus （Fisch）Bge.Var.mongholicus（Bge.）Hsiao］的干燥根，為我國傳統(tǒng)的補(bǔ)氣藥［1～3］。黃芪的藥用迄今已有2 000多年的歷史，大量的臨床研究證實(shí)，黃芪具有保護(hù)心臟及腎臟、雙向調(diào)節(jié)血糖及血壓、抗缺氧、抗自由基氧化、抗衰老、抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效［2～3］。目前甘肅黃芪栽培中普遍使用的品種為黃芪屬多種類型的混和體，田間表現(xiàn)良莠混雜，難于管理，且品種（系）親緣關(guān)系不明確，缺乏品種（系）鑒定的分子依據(jù)，嚴(yán)重制約著當(dāng)?shù)攸S芪的產(chǎn)量和品質(zhì)。另外，藥材的道地性一直是評(píng)價(jià)藥材品質(zhì)的綜合性標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)生道地性的原因，除了栽培方法、生態(tài)環(huán)境、加工方法外，還與物種居群的遺傳特異性有關(guān)。道地藥材與非道地藥材在形態(tài)和生藥性狀等特征上的差別并不明顯，這給應(yīng)用傳統(tǒng)方法鑒別道地藥材帶來了困難。

隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)以其操作簡單、快速、花費(fèi)少、DNA用量少、無放射性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中草藥種質(zhì)資源親緣關(guān)系、遺傳多樣性及藥材道地性研究等方面［4～5］。我們針對(duì)甘肅省黃芪生產(chǎn)及銷售實(shí)際中不能提供科學(xué)的藥材道地性鑒定等問題，利用RAPD技術(shù)對(duì)甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心新選育的2個(gè)黃芪品種（系）進(jìn)行分析鑒定，以考證其遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試黃芪樣品為隴芪1號(hào)（編號(hào)為HQ1）、HQN03-03（編號(hào)為HQ2），均由甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心提供。于2011年7月20日分別采集2個(gè)黃芪品種（系）的幼葉各50片，用硅膠干燥后帶回實(shí)驗(yàn)室。RAPD引物由北京奧科生物技術(shù)公司生產(chǎn)，所用Taq酶及dNTPs購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 采用SDS法提取植物基因組DNA［6～7］。稱取0.3 g干葉片，加液氮研磨至粉末狀移入離心管，加入4mL已預(yù)熱到65℃的提取液充分混勻，65℃水浴30min，每3min混勻1次。向離心管中加入等體積的氯仿異戊醇（24∶1）抽提1 h，8 000 r/min離心15min，取出上清液，再抽提2次，而后加入2倍體積的-20℃的無水乙醇，混勻后放在-20℃下靜置30min，吸出無水乙醇后加入70%乙醇，并輕柔混勻30 s，重復(fù)4～5次，以去除雜質(zhì)。將DNA挑出后放入已加入300 uL TE液的離心管中，待DNA完全溶解后分裝，4℃下保存待用。對(duì)提取的2個(gè)供試黃芪品種（系）的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，為后期PCR擴(kuò)增提供良好的模板。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD普通型PCR儀上進(jìn)行。采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，分析鑒別新選育出的2個(gè)黃芪品種（系）的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。采用SDS方法提取植物基因組DNA，利用RAPD—PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（①RAPD反應(yīng)體系模板DNA 1.2 uL，隨機(jī)引物2.0 uL，dNTPs 1.3 uL，Buffer 2.5 uL，Taq酶 0.5 uL，加ddH2O至25.0 uL；②擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min后，94℃1 min，35℃ 1 min，72℃ 2 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。然后采用1.4%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，UVI凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察照相。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 參照Williams等的方法［8］，電泳擴(kuò)增圖譜中的每一條帶（DNA片段）均為一個(gè)分子標(biāo)記（Marker），并代表一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)各分子標(biāo)記在相同電泳遷移率下（相同分子量片段）的有無，統(tǒng)計(jì)得到所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)，有DNA擴(kuò)增帶（顯性）為1，無帶（隱性）記為0，強(qiáng)帶和弱帶賦值為1。對(duì)于多態(tài)性位點(diǎn)，采用在重復(fù)試驗(yàn)中能穩(wěn)定出現(xiàn)的差異帶用于數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物對(duì)2個(gè)黃芪品種（系）的擴(kuò)增結(jié)果

從表1可以看出，通過引物篩選，分別從HQ1和HQ2中挑選出譜帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性較豐富的12條和13條隨機(jī)引物，用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。從HQ1挑選出的12條引物為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P10、 P12、P13、P14、P15 ，從 HQ2挑選出的13條引物為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P13、P15。從HQ1篩選出的12條引物共擴(kuò)增出112個(gè)位點(diǎn)，不同引物的擴(kuò)增位點(diǎn)變幅為7～13個(gè)，平均每條引物能擴(kuò)增出9.3個(gè)位點(diǎn)；從HQ2篩選出的13條引物共擴(kuò)增出107個(gè)位點(diǎn)，不同引物的擴(kuò)增位點(diǎn)變幅為6～12個(gè)，平均每條引物能擴(kuò)增出8.2個(gè)位點(diǎn)。

表1 2個(gè)新選育黃芪品種（系）的引物序列和擴(kuò)增結(jié)果

2.2 相同引物對(duì)2個(gè)黃芪品種（系）的擴(kuò)增結(jié)果

利用HQ1和HQ2可共用的12條引物，分別擴(kuò)增2個(gè)黃芪品種（系），從而在分子水平上反映2個(gè)黃芪品種（系）間的遺傳差異性。篩選出的12條引物分別為P1、P2、P3、P4、P5、P6、 P7、P9、P10、P13、P14、P15（引物及其擴(kuò)增條帶數(shù)見表1）。結(jié)果顯示，HQ1和HQ2的主譜帶基本一致，說明它們的遺傳背景具有很大的相似性，但是兩者間的次譜帶存在明顯差異。相同引物擴(kuò)增2個(gè)黃芪品種（系）產(chǎn)生的總位點(diǎn)數(shù)的范圍為13～25個(gè)；其中多態(tài)性位點(diǎn)的差異變幅為1～3個(gè)。這說明2個(gè)黃芪品種（系）間存在遺傳學(xué)差異，具有遺傳多態(tài)性位點(diǎn)（圖1）。

圖1 HQ1和HQ2的RAPD電泳圖譜

3 小結(jié)與討論

本研究對(duì)模板DNA含量和dNTPs含量兩個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化分析，建立了適合黃芪材料的RAPD—PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，并對(duì)引物退火溫度和電泳中瓊脂糖濃度進(jìn)行了篩選，最終確定了黃芪的最適RAPD—PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：模板DNA 1.2 uL，隨機(jī)引物2.0 uL，dNTPs1.3 uL，Buffer 2.5 uL，Taq酶0.5 uL，ddH2O 17.5 uL；RAPD引物最佳退火溫度為35℃，最適瓊脂糖濃度為1.4%。此體系的建立可以為其它黃芪品種（系）的RAPD擴(kuò)增提供參照依據(jù)。

RAPD是一種顯性標(biāo)記，能從分子水平上揭示材料間存在的遺傳差異［9～11］。從RAPD的結(jié)果可以看出，隴芪1號(hào)篩選出的12條引物共擴(kuò)增出112個(gè)位點(diǎn)，平均每條引物能擴(kuò)增出9.3個(gè)位點(diǎn)；HQN03-03篩選出的13條引物共擴(kuò)增出107個(gè)位點(diǎn)，平均每條引物能擴(kuò)增出8.2個(gè)位點(diǎn)。供試的2個(gè)黃芪品種（系）的主譜帶基本一致，說明它們的遺傳背景具有很大的相似性，2個(gè)黃芪品種（系）間遺傳關(guān)系較近。這種情況可能是由于供試的2個(gè)黃芪品種（系）在種植過程中地理分布近，且黃芪是自花不孕或自交不親和的異花授粉植物［12］，從而使二者間相互授粉的幾率大大提高，造成遺傳關(guān)系較近。但次譜帶存在不同程度的差異，從分子水平上說明這2個(gè)黃芪品種（系）具有一定的遺傳差異性，也體現(xiàn)了甘肅省黃芪品種（系）資源具有較豐富的遺傳多樣性。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（2010版）．（一部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：249-250.

［2］ 馬偉明，劉曉瑞，王春明，等.黃芪愈傷組織的誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2011（6）：30-32.

［3］ 劉曉瑞，尚虎山，汪淑霞，等.應(yīng)用高穩(wěn)系數(shù)法對(duì)黃芪品比試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2012（1）：14-16.

［4］ 鄭學(xué)項(xiàng)，馮素萍，李維國.DNA分子標(biāo)記研究進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（26）：12420-12422.

［5］ 任愛農(nóng)，秦民堅(jiān).基于RAPD分子標(biāo)記技術(shù)的中藥材鑒定研究進(jìn)展［J］. 中南藥學(xué)，2008，6（3）：338-341.

［6］ 王關(guān)林.植物基因工程（第2版）［M］.北京：科學(xué)出版社，2002：742.

［7］ 劉湘丹，周日寶，童巧珍，等.百合鱗葉總DNA提取方法的改進(jìn)［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（2）：12.

［8］ WILLIAMS J G，KUBELIK A R，Libak K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as geneticmarkers［J］.Nuc.Aci.Res.，1990，18（22）： 6531-6535.

［9］ 梁慧敏.不同居群狗牙根RAPD分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19 （1）：258-262.

［10］ 劉 歡，慕 平，趙桂琴.基于AFLP燕麥遺傳多樣性研究［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（6）：121-127.

［11］ 解新明，盧小良.利用RAPD標(biāo)記分析狼尾草屬牧草品種間的遺傳關(guān)系［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（2）：52-56.

［12］ 吳松權(quán)，廉美蘭.黃芪傳粉特性的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（21）：9148；9303.