孟學平，申 欣，趙娜娜，2，田 美，曾 云，陳建安，董志國，程漢良，閻斌倫

(1.淮海工學院海洋學院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，連云港 222005;2.南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，江蘇省海洋生物重點實驗室，南京 210095)

ITS2(The internal transcribed spacer 2)是真核生物5.8S和28S核糖體RNA(rRNA)基因間的DNA序列，此區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可為rRNA前體正確有效加工提供結(jié)構(gòu)元件和二級結(jié)構(gòu)。通常ITS2二級結(jié)構(gòu)5'端的2個結(jié)構(gòu)域非常保守，而3'端的結(jié)構(gòu)域變異較大。由于ITS2上述結(jié)構(gòu)特點，常被用于鑒別相關(guān)的種或推斷種內(nèi)和科間甚至更高分類水平的系統(tǒng)關(guān)系［1-3］。線粒體核糖體16S rRNA也適合解決雙殼類近緣種或類群的系統(tǒng)關(guān)系［4-6］。來自細胞核的ITS2和線粒體DNA的16S一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)相結(jié)合也被用來研究雙殼類同科不同種類的遺傳關(guān)系［1］或同屬不同種的系統(tǒng)發(fā)生分析［7］。西施舌(Coelomactra antiquata)是雙殼綱蛤蜊科(Mactridae)的一種海產(chǎn)名貴經(jīng)濟貝類，其肉質(zhì)細膩，營養(yǎng)豐富［8］，具有極高經(jīng)濟價值［9］。我國專家對西施舌群體形態(tài)［10-12］、生化［13-14］、分子遺傳差異及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進行了卓有成效的研究工作，但目前西施舌群體遺傳背景尚不清晰，研究結(jié)果存在分歧:多數(shù)資料認為福建(長樂、漳州)西施舌發(fā)生了明顯遺傳分化，可能是一個亞種或隱種［15-20］;少數(shù)資料認為長樂西施舌與其它群體未達到種間差異的水平［14］;此外，一些研究認為廣西北海西施舌與江蘇、山東、遼寧西施舌群體親緣關(guān)系近，與福建群體親緣關(guān)系遠［15，17-18］，另一些研究結(jié)果認為廣西西施舌與福建西施舌遺傳關(guān)系近［12］;要澄清上述分歧、確定福建西施舌是否是一個新種，需要更多的形態(tài)、生物和分子生物學資料佐證。本研究擬從核基因組DNA和線粒體基因組DNA兩個方面研究我國不同地理群體西施舌遺傳差異，從ITS2和16S一、二級結(jié)構(gòu)2個層次分析群體間差異，為我國西施舌群體遺傳關(guān)系和福建西施舌分類地位的確定提供更多分子生物學證據(jù)。對西施舌的增養(yǎng)殖學和野生資源保護和科學利用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

本研究西施舌樣本分別來自遼寧大連(DL)(樣本數(shù)為4)、山東膠南(JN、JD)(2)、江蘇連云港(LYG)(32)、啟東(QD、XM)(34)，福建的長樂(CL)(35)，廣西北海(GX)(16)、越南(YN)(1)等海區(qū)，共124個;另一部分序列來源于GenBank中其他作者提交的序列，分別隸屬Q(mào)D(3)、GX(1)、CL(7，包括X1)、山東的日照(RZ)(2)、即墨(JM)(4)和JN(4)、平潭(X2)，LYG(X3)等海區(qū)，共計23個序列。樣本信息見表1、表2，因提交的序列為單倍型或基因型，GenBank中未反映出每個單倍型或基因型的樣本數(shù)，因此，本實驗把每個單倍型或基因型作為1個個體對待。本實驗所用實驗樣本在2005年12月到2011年12月采集。

表1 西施舌ITS2核苷酸序列信息Table 1 The information of ITS2 nucleotide sequences of Coelomactra antiquata

1.2 DNA提取、擴增及序列測定

樣本總DNA按2010年Oliverio［21］的方法從閉殼肌或斧足肌肉中提取。純化的DNA定量測定后作為ITS2和16S序列PCR擴增的模板。ITS2 PCR引物(primer，P)為ITS2-P1(5'GTTTCTTTTCCTCCGCTTACT3')和ITS2-P2(5'CACACTGAACATCGACAGCTT3')，擴增產(chǎn)物450bp左右，包括5.8S和28S rRNA基因部分序列以及 ITS2全序列。16S部分序列 PCR引物為 16S3L(5'TGAGCGTGCTAAGGTAG3')和 16S4H(5'AGCCAACATCGAGGTCGC3')。擴增產(chǎn)物為 350 bp。在 25 μL 反應(yīng)體系中，ddH2O 17.3 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，10×buffer 2.5 μL，Mg2+(10 mmol/L)2.5 μL，引物(25 μmol/L)各 0.5 μL，模板(20—50 ng)1 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL。反應(yīng)程序為 94 ℃ 預(yù)變性 3 min，然后 35 個循環(huán):94 ℃ 變性 30'，52 ℃ 退火30'，72℃延伸50'，最后72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)在Bio-Rad C1000 PCR儀上進行。PCR產(chǎn)物用ABIPRISM3730測序儀雙向測序。

1.3 序列比對分析

DNA序列用DNAStar軟件組裝，結(jié)合測序峰圖進行序列人工校對，用 ClustalX［22］軟件排序取齊，通過DnaSP 5.0軟件統(tǒng)計各群體的單倍型或基因型，利用MEGA 4［23］分析序列特征、計算遺傳差異和遺傳距離，構(gòu)建NJ(Neighbor-joining)和 MP(Maximum parsimony)系統(tǒng)進化樹;用The mfold Web Server(http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold)進行DNA和RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

表2 西施舌16S rRNA基因片段信息Table 2 The information of 16S rRNA gene fragments of Coelomactra antiquata

2 結(jié)果

2.1 ITS2和16SrRNA基因序列信息

本研究西施舌樣本來源于我國南北沿海的9個海區(qū)及鄰近廣西北海的越南海域，共獲得147條DNA序列，其中ITS2序列74條，16S序列73條。本研究擴增獲得西施舌ITS2序列68條，16S序列56條(表2);從GenBank下載的ITS2序列6條，16S序列17條。

用DnaSPv5分析ITS2獲得17種基因型(genotype，Gen)(Gen1-17)(表1)，每種基因型的出現(xiàn)頻率不同，其中Gen3出現(xiàn)頻率最高，為32.4%(24/74)，Gen2出現(xiàn)頻率次之，為23.0%，頻率為5%—7%的基因型有4種，其余11種基因型出現(xiàn)頻率分別為1.4%和4.1%。CL(包括YN群體)群體特有基因型有9種(Gen6—14)，不與其它群體共享。此外，GX、JM、JN和RZ群體各有1—2個群體特有基因型。Gen1—Gen3為非長樂群體交叉共享基因型，其中Gen3為GX、QD、LYG、DL 4個群體共享;Gen1為GX、QD、LYG 3個群體共享。廣西北海群體的ITS2基因型與北方群體基因型有交叉共享現(xiàn)象，與南方的長樂群體無共享。

16S序列共有15個單倍型(haplotype，Hap)(表2)，其中 Hap1、3、4、8、14 為 CL 群體特有單倍型，有4 種單倍型為2個以上群體交叉共享。如Hap2為膠南、即墨、連云港、啟東和X群體共享;Hap9為北海(GX)和日照群體共享。QD、JM 2個群體共享Hap11，JN、JM 2個群體共享Hap10。膠南、連云港、啟東、北海群體除具體有共享單倍型外，尚有1—2個群體特有的單倍型。Hap2和Hap1出現(xiàn)頻率較高，分別為34.2%和17.8%，其余單倍型出現(xiàn)頻率均低于8%。

2.2 ITS2和16S rRNA序列比對分析

本研究測得的西施舌ITS2全序列長度在389—401 bp之間，有核苷酸的插入/缺失現(xiàn)象。

對ITS2序列兩端取齊后獲得370—380 bp片段用于序列比對。ITS2序列分析顯示，17種基因型有23個變異位點(圖1A)，占比對位點的5.7%(23/401)，其中簡約信息位點16個，占4.0%(16/401)。CL群體9種基因型有6個共享變異位點，分別是第226位的堿基T，273—275位的TCT，317位的T和381位的G。而其它群體無共享變異位點。

根據(jù)ITS2 17種基因型核苷酸序列的變異，計算了不同群體間遺傳距離(考慮文章篇幅太大，不同基因型間的遺傳距離表格略)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CL群體與nCL群體間的遺傳距離在0.019—0.042之間，平均為0.029，群體內(nèi)的遺傳距離為0.005—0.022，平均為0.012，CL和 nCL群體間與群體內(nèi)遺傳距離之比為2.42(0.029/0.012)，而其余的DL、JM、JN、RZ、LYG、QD和GX群體間有交叉共享基因型，因此，將其列為一組，組內(nèi)遺傳距離為0.003—0.014，平均為0.007。由此可見，西施舌CL群體與nCL群體遺傳差異極為明顯。

本研究所測定的16S片段多數(shù)為306bp，GenBank下載的其他作者提交的序列有的多于360 bp，序列比對前將兩端多余序列去除取齊，獲得的比對序列長度均為306 bp。對15種16S單倍型序列比對發(fā)現(xiàn)，有35個變異位點(圖1B)，占比對位點的11.40%(35/306)，其中簡約信息位點24個，占7.84%。CL群體5個單倍型變異位點28個(9.15%)，其中有23(7.5%)個變異位點為5種單倍型共享。

圖1 西施舌ITS2(基因型)(A)和16S rRNA基因片段(單倍型)(B)變異位點Fig.1 The ITS2(genotype，Gen)(A)and 16S rRNA gene fragments(haplotype，Hap)(B)diversity sites of Coelomactra antiquata

基于16S序列所得各單倍型間的遺傳距離如表3，灰色背景里的數(shù)字為CL群體與nCL群體間的遺傳距離，在7.7%—9.5%之間，平均為8.1%。長樂群體內(nèi)個體間的遺傳距離在0.3%—1.0% 之間，平均為0.7%，群體間遺傳距離與群體內(nèi)遺傳距離之比為11.6。長樂以外的JM、JN、LYG、QD和GX 5個群體9種單倍型間的遺傳距離在0.3%—1.7%之間，平均為0.9%，遠遠小于長樂群體與非長樂群體之間的遺傳距離。

表3 西施舌16S rRNA基因片段的遺傳距離Table 3 The genetic distances based on 16S rRNA gene fragments of Coelomactra antiquata

2.3 基于ITS2和16S核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS2和16S核苷酸序列，以與西施舌共屬一個科的中國蛤蜊(Mactra chinensis)和四角蛤蜊(Mactra veneriformis)作為外群，用鄰接法(NJ)和最大吝嗇法(MP)分析了西施舌9個群體親緣關(guān)系(圖2)，兩套DNA資料構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹均顯示CL群體(包括YN群體)均聚為支持率很高的單系支，在ITS2的NJ和MP樹中支持率分別為96和95;在16S的NJ(圖2，B)和MP(圖略)樹中，支持率分別為100和99，而其余的8個群體無一個群體聚為單系支，只是交叉聚為支持率很高的一支［16S:支持率為98/96(NJ/MP)］。因ITS2和16S資料之間不是對應(yīng)關(guān)系，因此，未將兩套資料排列在一起構(gòu)建進化樹，盡管如此，但分別聚類結(jié)果也高度一致。

圖2 基于ITS2基因型(A)和16S rRNA基因單倍型(B)的西施舌不同群體N-J樹Fig.2 The N-J tree based on ITS2(genotypic，Gen)(A)and 16S rRNA gene fragments(haplotype，Hap)(B)of C.antiquata different stocks

2.4 ITS2和16S二級結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)ITS2和16S的序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。對基因型Gen3(DL、LYG、QD、GX群體共享)、Gen6(CL群體的一種基因型，命名為CL12-)和Gen10(CL群體的另一種基因型，命名為CL12+)3個有代表性的ITS2二級結(jié)構(gòu)進行詳細分析(圖3)。結(jié)果顯示nCL群體ITS2二級結(jié)構(gòu)高度相似，幾乎無差異。CL群體與nCL群體ITS2二級結(jié)構(gòu)的a、b 2個結(jié)構(gòu)域相同，但位于a、b區(qū)之間的c、d、e三個區(qū)域有明顯的差異，c、d區(qū)是CL群體特有區(qū)域，而e區(qū)是nCL區(qū)域特有。根據(jù)c區(qū)的差異又可把CL群體的ITS2二級結(jié)構(gòu)分為CL12-(圖3B-c)和CL12+(圖3C-c)2種類型。CL12-型和CL12+型二級結(jié)構(gòu)極為相似，但結(jié)構(gòu)域c有差異，結(jié)構(gòu)域c的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖部結(jié)構(gòu)完全相同，但是環(huán)狀結(jié)構(gòu)差異很大，B-c中的環(huán)由ACTCGTT共7個堿基組成，而C-c比B-c環(huán)大，由19個堿基組成，在B-c中環(huán)的G與T之間插入一個12個核苷酸(CTTTACCGCTTG)序列;之外，圖3B-c和C-c莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3'側(cè)翼堿基組成也不同，B-c中3'側(cè)翼只有一個堿基T，而C-c中3'側(cè)翼為TCGC，比B-c多3個核苷酸(CGC)。上述結(jié)果證實ITS2基因型Gen3與Gen6、Gen10二級結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯不同，極易區(qū)分。而CL群體與非長樂群體ITS2二級結(jié)構(gòu)a、b區(qū)相同，難以區(qū)別。長樂群體的CL12-和CL12+2種類型與生理或其它形態(tài)性狀有什么關(guān)系，深入研究。

圖3 西施舌ITS2二級結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Comparation of the ITS2 secondary structure of Coelomactra antiquata

根據(jù)二級結(jié)構(gòu)形狀，可將16S片段15個單倍型分為2大類，第一類包括5種單倍型(Hap1，3，4，8，14)(圖4A)，這一類16S二級結(jié)構(gòu)的共同特點是主干莖環(huán)區(qū)較短，5種二級結(jié)構(gòu)中的DI和DII區(qū)均相同(圖4ADI，A-DII)，DIV 區(qū)在其中的2 種(Hap1，14)二級結(jié)構(gòu)中相同;第二類包括 10 種單倍型(Hap2，5-7，9-13，15)，其共同的二級結(jié)構(gòu)特點是主干莖環(huán)區(qū)較長(圖4B)，有2個區(qū)域(B-DI，B-DII)在10種單倍型中相同，且這兩個區(qū)域堿基所占比例較大。有趣的是第一類16S二級結(jié)構(gòu)中包含的單倍型均為CL群體所有，第二類二級結(jié)構(gòu)中全部為nCL群體所有。A-DI、A-DII為第一類二級結(jié)構(gòu)特有結(jié)構(gòu)域，B-DI、B-DII(多數(shù))是第二類二級結(jié)構(gòu)所特有，通過這四個結(jié)構(gòu)域極易將西施舌CL群體和nCL群體區(qū)別開來。

3 討論

3.1 ITS2和16S資料支持福建西施舌是腔蛤蜊屬的一個新種

一直以來，中國南北沿海西施舌被認為是一個種，無人置疑過。近年來，一部分分子生物學和形態(tài)學的資料認為福建群體與其它群體間的差異達到了種間差異水平，福建漳州或長樂西施舌是西施舌的一個亞種或隱種。但是要確定長樂西施舌的分類地位，僅現(xiàn)有的資料還不夠充分，還需更多的生物學和分子生物學資料的支持。本研究用核DNA(ITS2)和線粒體DNA(16S)序列資料對我國南北沿海9個群體西施舌遺傳差異分析結(jié)果顯示，基于16S核苷酸序列的CL群體與nCL群體間遺傳距離平均為8.1%，而nCL群體間的遺傳距離平均為0.7%。與西施舌同屬簾蛤目(Veneroida)的文蛤?qū)俚奈母騇eretrix meretrix(GQ463598)、麗文蛤Meretrix lusoria(GQ903339)和中華文蛤Meretrix petechialis(EU145977)3種貝類間(基于16S)遺傳距離為0.5%—6.7%;貽貝目貽貝屬(Mytilus)的紫貽貝Mytilus galloprovincialis(AY363687)，貽貝Mytilus edulis(AY823623)和油黑殼菜蛤Mytilus trossulus(DQ198225)3種貝類(基于16S)的遺傳距離為0.2%—0.7%。均小于西施舌CL群體與nCL群體間的遺傳距離，這些資料從側(cè)面證實CL群體與nCL群體的差異達到了種間差異水平。ITS2、16S二級結(jié)果顯示CL群體內(nèi)不同基因(單倍)型結(jié)構(gòu)相似，nCL群體內(nèi)各群體間二級結(jié)構(gòu)相似(圖3，圖4)，但CL、nCL群體間的二級結(jié)構(gòu)明顯不同。ITS2和16S二級結(jié)構(gòu)比較結(jié)果提示中國西施舌存在新種，即福建西施舌可能是腔蛤蜊屬的一個新種。這個結(jié)果與 ITS1［15］、COX1［18］、cytb［17］、AFLP［19］、形態(tài)學分析［10，11］結(jié)果一致。

圖4 西施舌16S rRNA基因單倍型二級結(jié)構(gòu)比較Fig.4 Comparation of the16S rRNA gene hyplotype secondary structure of Coelomactra antiquata

Hebert等［24］基于細胞色素C氧化酶亞基3(cox3)核苷酸序列，計算了軟體動物的1155個同屬內(nèi)物種對的遺傳距離，平均為11.1%。此外，Hebert等［25］提出群體間差異若為群體內(nèi)個體間差異的10倍，則認為這種差異達到種的水平，即“10×”規(guī)則。日照西施舌與漳州(同長樂西施舌的差異屬種內(nèi)差異)［18］西施舌cox1全序列核苷酸差異(divergence)為14.5%，大于軟體動物同屬不同種間的差異水平，也達到“10×”規(guī)則的水平。Ni等［26］對蛤蜊科11種貝類cox1和16S序列差異分析顯示，cox1的種內(nèi)遺傳距離低于2.5%，而屬內(nèi)種間遺傳距離為8.2%—28.4%，是種內(nèi)遺傳距離的3.2—11.4倍，最小種間(M.coralline和 M.lignaria)遺傳距離為8.5%—9.3%。由此可見，CL和nCL群體西施舌遺傳差異也達到蛤蜊科同屬不同種間差異水平;11種貝類16S的種內(nèi)和種間遺傳距離分別為0—0.9%，1.4%—27.1%，種間遺傳距離是種內(nèi)的1.6—30.1倍。本研究結(jié)果顯示西施舌16S的CL與nCL群體間遺傳距離為8.1%，是CL群體內(nèi)(0.7%)的11.6倍，此差異水平在蛤蜊科11種貝類種間差異水平范圍內(nèi)。孟學平比較漳州與日照西施舌線粒體全基因組顯示，兩者的主非編碼區(qū)(MNR)所在位置雖然相同，但大小和序列存在明顯差異，前者無串聯(lián)重復(fù)序列，而后者有11個拷貝的99個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，且兩者的MNRs無可比性［27］。Xu等［28］對巴非蛤?qū)?Paphia)4種不同貝類線粒體全基因組比較研究顯示，Paphia undulata和P.textile的MNR所在位置相同，均有串聯(lián)重復(fù)區(qū)，只是串聯(lián)重復(fù)單位大小和的拷貝數(shù)不同。同種不同個體mtDNA MNR若存在串聯(lián)重復(fù)區(qū)，其拷貝數(shù)可能有變化(異質(zhì)性)，但同種不同個體MNR的有和無的現(xiàn)象目前在雙殼類中尚未發(fā)現(xiàn)。因此，mtDNA MNR的差異也強有力地支持漳州西施舌與日照西施舌的差異達到種的水平，這與本研究的結(jié)果一致。

3.2 西施舌廣西北海群體與遼寧、山東和江蘇群體差異用ITS2、16S標記不易區(qū)分

廣西北海大陸海岸線離北方沿海(如江蘇啟東)最近也有7000多公里，本研究ITS2和16S資料證實西施舌北海群體(GX)與北方群體(JM、JN、RZ、LYG、QD和DL)親緣關(guān)系近，基于16S和ITS2的遺傳距離分別為0.005—0.010 和0.005—0.016，與福建群體遺傳關(guān)系遠(遺傳距離 16S/ITS2:0.080—0.088/0.022—0.036)。此外，廣西群體16S和ITS2均有與北方群體共享單倍型或基因型，與CL群體無共享單倍型或基因型。這充分說明廣西群體與北方群體的遺傳關(guān)系近，與福建群體遺傳關(guān)系遠。cox1［18］、cob［17］、ITS1［15］資料也與本研究結(jié)果一致。這種現(xiàn)象與地理距離與遺傳關(guān)系遠近的一般規(guī)律不相符。此種現(xiàn)象在巴非蛤［29］和青蛤［30］不同群體中也存在。造成這種現(xiàn)象的原因之一可能是人為因素造成。尤仲杰對山東膠南、江蘇南通、浙江臺州、福建福州、廣西北海5個群體的RAPD分析證實廣西北海西施舌分化最大，可能形成了一個地理種群，而福州西施舌未形成地理種群［12］;等位酶的研究也認為北海西施舌形成了地理種群［14］。本研究結(jié)果與RAPD［12］、等位酶的研究結(jié)果有分歧。因此，關(guān)于廣西西施舌與其它群體的遺傳關(guān)系需要用更有說服力的生物及分子生物學資料作深入研究。

致謝:感謝東華大學孟清教授、意大利博洛尼亞大學Plazzi博士和美國北卡羅來納州立大學Raley博士對本文英文摘要的修改潤色。

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