黃林芳，李文濤，王 珍，付 娟，陳士林

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)院藥用植物研究所資源中心，北京 100193)

我國氣候生境的多樣性，形成了特有的中藥材多道地、多產(chǎn)地現(xiàn)象［1］。道地藥材的生長要求特定的生長溫度、濕度、降水等自然生態(tài)環(huán)境條件。研究適宜道地藥材生長的生態(tài)環(huán)境是中藥資源可持續(xù)發(fā)展的重要命題［2］。中藥資源生態(tài)學(xué)是中藥資源與生態(tài)學(xué)相結(jié)合的一門新興學(xué)科［3］，中藥材品質(zhì)與生態(tài)因子相關(guān)性研究是其重要組成部分［4］。課題組前期研究表明，相對濕度和年降水量是影響黃花蒿中青蒿素積累的主導(dǎo)因子［5］。溫度在人參中的皂苷類成分的積累中起著決定性作用［6］。Jing［7］等認為土壤類型是影響枸杞多酚類含量的主要因素。Shuting Yang等［8］發(fā)現(xiàn)玄參中玄參苷的積累與溫度呈正相關(guān)性。

羌活為大宗藥材品種。具有解表散寒、勝濕止痛的作用，為中、藏、羌醫(yī)藥體系中的常用藥材［9-10］，主要化學(xué)成分是羌活醇和異歐前胡素［11］。四川、青海、甘肅為羌活三大主產(chǎn)區(qū)［12］。羌活主要分布于高原寒冷陰濕地帶，生長周期長［13］，加之市場需求增長，野生資源已面臨嚴重危機［14］?！吨袊湎l危保護植物名錄》已將羌活列為二級保護物種，并載入《中國物種紅色名錄》［15］。目前對羌活的研究集中在真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評價方面，對羌活產(chǎn)地的生態(tài)因子與其化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)尚無報道。本研究對四川、青海、甘肅羌活主產(chǎn)地羌活的羌活醇和異歐前胡素進行含量測定，應(yīng)用中國氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享服務(wù)平臺(http://cdc.cma.gov.cn/)獲得了不同產(chǎn)地的生態(tài)因子值，應(yīng)用偏最小二乘回歸分析(PLS)、冗余分析(RDA)及主成分分析(PCA)方法探討了羌活活性成分與產(chǎn)地及氣候因子的關(guān)聯(lián)性，研究結(jié)果為瀕危物種羌活保護與利用、可持續(xù)發(fā)展及引種栽培提供參考。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

栽培羌活、寬葉羌活兩年生藥材于2010年10月下旬采收自四川、甘肅、青海等省，栽培羌活54個樣品，寬葉羌活11個樣品共計65個樣本(圖1)。將藥材粉碎，過3號篩，經(jīng)HPLC測定其含量。原植物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所黃林芳副教授鑒定為羌活(N.incisum)和寬葉羌活(N.franchetii)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Waters 1525 HPLC系統(tǒng)(Milford，MA，USA)，Waters AF型在線脫氣機，Waters 1525 HPLC型二元泵，Waters 717型自動進樣器，恒溫柱箱以及Breeze色譜工作站。

1.2.2 試劑

甲醇、乙腈(Fisher，色譜純)、磷酸(Sigma，色譜純)、其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 羌活化學(xué)成分含量測定

2.1.1 對照品

異歐前胡素(批號:110827)購自中國藥品生物制品檢定所，羌活醇(批號:0773—9607)購自上海同田生物，純度經(jīng)高效液相色譜分析大于98%。

圖1 羌活及寬葉羌活采樣點空間地理分布(▲為羌活采樣點，●為寬葉羌活采樣點)Fig.1 Collection sites of geographic distribution for N.incisum and N.franchetii

2.1.2 對照品溶液制備

分別精密稱取2 mg羌活醇和異歐前胡素分別溶于甲醇中，振搖使混合均勻，配制成混合對照品儲備液。4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 供試品溶液的制備

分別取約2.0 g羌活、寬葉羌活樣品，精密稱定，加入25 mL甲醇至具塞錐形瓶中，稱重。超聲30min處理后補足差重。過濾，進樣前經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，準備進樣。

第六，表面淬硬層組織細，硬度高，耐磨性好，能滿足淬硬層深度較淺（一般在0.3～2.0mm）表面淬火產(chǎn)品。

2.1.4 色譜條件

XBridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm i.d.，Waters，USA)，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，樣品進樣體積10 μL。流動相組成乙腈(A)和0.01%磷酸水 (B)。檢測波長310 nm。色譜條件如下［11，15］:0—13 min，13%—17%A;13—20 min，17%A;20—22 min，17%—44%A;22—31min，44%—57%A;31— 38 min，57%A;38—45 min，57%—100%A;45—50 min，100%A。

2.1.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品儲備液2、10、40、100、200、400、600 μL 至1 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，按上述色譜條件進行HPLC分析，以各標準品的濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，得到各線性回歸的方程。最小檢測限(LOD)和最小定量限(LOQ)定義為信噪比分別等于3(S/N=3)和10(S/N=10)時對應(yīng)的含量(表1)。

表1 羌活醇及異歐前胡素的標準曲線，LOD and LOQTable 1 Standard curve of Notopterol and Isoimperatorin，LOD and LOQ

2.1.6 精密度試驗

分別在1 d和連續(xù)3 d內(nèi)吸取上述混合標準儲備液400 μL，稀釋至1 mL，進樣體積10 μL，在所確定的HPLC條件下重復(fù)進樣6次測定，記錄各成分色譜峰面積，計算其質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果羌活醇、異歐前胡素在72 h內(nèi)的 RSD 為2.26%，1.71%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗

取上述對照品溶液，分別在0、2、4、8、12、24、36 h，按上述測定方法進行測定，記錄峰面積，各對照品色譜峰的峰面積對應(yīng)的濃度的RSD值在1.06%和1.02%范圍內(nèi)，表明樣品至少在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重現(xiàn)性試驗

2.1.9 加樣回收率

取已知含量的同一批次的樣品6份，每份約2.0 g，精密稱定，分別精密加入一定量(相當于樣品中的量)各對照品，按供試品溶液的制備方法操作，按上述色譜條件測定，各對照品的回收率在95.57%—99.23%范圍內(nèi)。

2.2 生態(tài)因子與化學(xué)成分分析(PLS)

2.2.1 生態(tài)因子獲取

登錄中國氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享服務(wù)網(wǎng)數(shù)據(jù)查詢系統(tǒng)，中國地面國際交換站累年年值數(shù)據(jù)集。包括9個因素:年降水量，年平均溫度，年平均最低溫度，年平均最高溫度，年相對濕度，日照時數(shù)，海拔，年平均風速，年平均氣壓(表2，表3)。

2.2.2 生態(tài)因子與化學(xué)成分PLS分析及產(chǎn)地主成分分析(PCA)

應(yīng)用simca-p軟件對生態(tài)因子和含量數(shù)據(jù)庫進行建模，考慮p個因變量y1，y2，…，yp，m個自變量x1，x2，…，xm，首先在自變量中提取第一主成分t1，因變量中提取第一主成分u1，使t1和u1的相關(guān)程度達到最大，然后建立因變量y1，y2，…，yp于t1的回歸。如果方程已達到滿意的精度，則算法終止。選擇信息提取和解釋能力較強的主成分作為典型成分。用Canoco軟件對化學(xué)成分數(shù)據(jù)先進行去趨勢對應(yīng)分析(DCA)，觀察模型的整體情況，然后將環(huán)境因子數(shù)據(jù)加到排序圖上，進行冗余分析(RDA)。解讀排序圖，兩個箭頭之間的夾角的余弦值代表了之間的相關(guān)性。余弦值的大小代表了兩者之間關(guān)系的強弱。用Unscrambler結(jié)合氣象數(shù)據(jù)與化學(xué)數(shù)據(jù)進行主成分分析，找出具有代表性的因子，區(qū)劃最優(yōu)產(chǎn)地。

3 結(jié)果

3.1 羌活與寬葉羌活化學(xué)成分含量分析

圖2、圖3可見，羌活中羌活醇含量較高，異歐前胡素含量較低，而在寬葉羌活中羌活醇的相對含量較低，異歐前胡素的含量較高。由圖3可知，羌活與寬葉羌活在不同產(chǎn)地中化學(xué)含量存在明顯差異，四川產(chǎn)羌活化學(xué)含量較青海高。寬葉羌活中不同產(chǎn)地化學(xué)含量比較，異歐前胡素含量顯著高于羌活醇，尤其在甘肅產(chǎn)寬葉羌活中。

圖2 羌活及寬葉羌活中羌活醇和異歐前胡素含量Fig.2 Contents of Notopterol and Isoimperatorin of N.incisum and N.franchetii

圖3 不同產(chǎn)地中羌活及寬葉羌活化學(xué)含量Fig.3 Chemical content of N.incisum and N.franchetii in different regions

3.2 羌活及寬葉羌活化學(xué)成分與生態(tài)因子PLS分析

采用偏最小二乘模型回歸系數(shù)的迭代計算與輔助分析技術(shù)，通過變量投影重要性指標(VIP)來評估羌活化學(xué)成分與生態(tài)因子關(guān)聯(lián)性，值越大說明解釋變量的重要程度越大。在羌活中羌活醇和異歐前胡素的回歸系數(shù)見圖4(A、C)，變量投影重要性指標VIP見圖4(B、D)。

圖4 羌活中羌活醇和異歐前胡素的生態(tài)因子回歸系數(shù)(A、C)及變量投影重要性指標(B、D);x1氣壓;x2年均溫;x3年最高溫;x4年最低溫;x5相對濕度;x6年降水量;x7風速;x8日照時數(shù);x9海拔Fig.4 Regression coefficient of ecological factor(A，C)and Variable importance in projection values(VIP)(B，D)of Notopterol and Isoimperatorin of N.incisum.x1 Air pressure;x2 Average annual Temperature;x3 Maximum annual Temperature;x4 Minimum annual Temperature;x5 Relative humidity;x6 Annual precipitation;x7 Wind speed;x8 Sunshine duration;x9 Elevation

由圖4(A)可知，羌活中日照時數(shù)與羌活醇含量的正回歸系數(shù)絕對值最大，其次是年降水量，相關(guān)度的排序為日照時數(shù)＞降水量＞年最高溫度＞海拔＞年均溫度＞年最低溫度。風速與羌活醇的負回歸系數(shù)絕對值最大，其次是氣壓和濕度。圖4(B)的VIP直方圖，日照時數(shù)和年降水量的權(quán)重系數(shù)與其它變量相比影響最大，其后依次是海拔＞年最高溫＞風速＞氣壓＞年均溫＞年最低溫＞濕度。綜合圖4(A)和(B)可知，日照時數(shù)和年降水量是影響羌活中羌活醇含量的最主要因素，且為正相關(guān)。海拔與年最高溫度也與羌活醇呈正相關(guān)。羌活中另一個主要化學(xué)成分異歐前胡素的生態(tài)因子系數(shù)回歸圖如圖4(C)所示，日照時數(shù)與異歐前胡素的含量回歸系數(shù)為正值，其余生態(tài)因子都為負值。其中年降水量的負回歸系數(shù)絕對值最大。年均溫、年最高溫、年最低溫與異歐前胡素的負回歸系數(shù)排在第二，濕度和氣壓的負回歸系數(shù)排在第三。圖4(D)的異歐前胡素VIP生態(tài)因子直方圖中，年降水量的權(quán)重系數(shù)最大排在第一，其次為年最高溫≈年均溫≈年最低溫排＞氣壓≈風速≈海拔≈濕度＞日照時數(shù)。年降水量和溫度因素是影響異歐前胡素含量的主要因素，皆為負相關(guān)。通過4個圖比較，發(fā)現(xiàn)在羌活中影響羌活醇和異歐前胡素含量的生態(tài)因子呈相反的趨勢，如日照和年降水量、海拔、溫度與羌活醇都為正相關(guān)，而與異歐前胡素呈負相關(guān)。

圖5 寬葉羌活羌活中羌活醇和異歐前胡素的生態(tài)因子回歸系數(shù)(A、C)及變量投影重要性指標(B、D);x1氣壓;x2年均溫;x3年最高溫;x4年最低溫;x5相對濕度;x6年降水量;x7風速;x8日照時數(shù);x9海拔Fig.5 Regression coefficient of ecological facter(A，C)and Variable importance in projection values(VIP)(B，D)of Notopterol and Isoimperatorin of N.franchetii;x1 Air pressure;x2 Average annual Temperature;x3 Maximum annual Temperature;x4 Minimum annual Temperature;x5 Relative humidity;x6 Annual precipitation;x7 Wind speed;x8 Sunshine duration;x9 Elevation

寬葉羌活中羌活醇和異歐前胡素的生態(tài)因子回歸系數(shù)見圖5(A，C)和變量投影最要性指標VIP見圖5(B，D).從圖5(A)中可看出，在寬葉羌活中海拔與羌活醇含量呈正相關(guān)，且回歸系數(shù)最大，其后依次是年降水量＞風速＞濕度＞日照。氣壓與羌活醇的負回歸系數(shù)絕對值最大，呈強負相關(guān)關(guān)系，其次是年均溫＞年最高溫＞年最低溫。圖5(B)的VIP直方圖可見，海拔、風速和年降水量分別排在前3位，是影響寬葉羌活中羌活醇的主要因素，其次為氣壓＞年均溫＞年最低溫＞年最高溫＞日照＞濕度，寬葉羌活中高海拔，和高風速，高降水有利于羌活醇的積累。結(jié)果同影響羌活中羌活醇的生態(tài)因子相一致。圖5(C)寬葉羌活異歐前胡素的系數(shù)回歸圖中，海拔的負回歸系數(shù)絕對值最大。年降水量，風速和濕度排在其次。年最高溫，年最低溫，年均溫負回歸系數(shù)最小。日照時數(shù)和氣壓與其呈正相關(guān)。圖5(D)中，海拔、年降水量和風速對異歐前胡素含量的影響最大。年最高溫、年均溫、年最低溫、濕度、氣壓、日照對異歐前胡素的影響排在其次。

3.3 不同產(chǎn)地羌活和寬葉羌活含量與生態(tài)因子的RDA雙向排序圖

如圖6(A)所示，圖中的藍色箭頭代表羌活的化學(xué)含量，紅色箭頭代表生態(tài)因子。以羌活中的羌活醇為例，其與日照時長，和平均風速的夾角分別為α，β，前者是個銳角，后者是個鈍角，相應(yīng)的余弦值代表了之間的相關(guān)性，羌活醇與日照時長呈現(xiàn)了較好的正相關(guān)，與平均風速呈現(xiàn)了較好的負相關(guān)。年降水量、年平均溫度、年最高溫度、年最低溫度、海拔都與羌活醇呈較好的正相關(guān)。氣壓、相對濕度與羌活醇呈較好的負相關(guān)，與3.1的研究結(jié)果相符合。異歐前胡素與相對濕度，平均風速，氣壓呈現(xiàn)較好的正相關(guān)，與日照時數(shù)呈現(xiàn)微弱的正相關(guān)，與海拔、年最高溫度、年最低溫度、年均溫度、年降水量呈現(xiàn)較好的負相關(guān)，與上述結(jié)果有細微的差別，可能是不同分析方法所致，Canoco先對模型進行去趨勢對應(yīng)分析(DCA)，選中合適的模型，然后采用冗余分析(RDA)進行排序，主要采用排列方法學(xué)的生態(tài)模型。如圖6(B)所示寬葉羌活中的羌活醇與年降水量、海拔、風速、日照時數(shù)的夾角為銳角，呈現(xiàn)出良好的正相關(guān)，與相對濕度呈微弱的正相關(guān)。并且與年平均溫，年最高溫，年最低溫，氣壓的夾角是鈍角，呈現(xiàn)出負相關(guān)。異歐前胡素與氣壓，年最高溫，年最低溫，年均溫夾角為銳角，呈正相關(guān)。與相對濕度，日照時數(shù)，年降水量，海拔的夾角為鈍角，呈負相關(guān)。與上述PLS結(jié)果有些差別，雖然溫度因子在兩種計算方法中出現(xiàn)了相反的趨勢，不過由于溫度因子的解釋變量的重要性小于海拔和年降水量，對分析結(jié)果影響不大，主導(dǎo)的生態(tài)因子通過兩種軟件的分析結(jié)果的相同的。

圖6 羌活(A)和寬葉羌活(B)含量與生態(tài)因子RDA雙向排序圖Fig.6 RDA two-way rank on content and ecological factors of N.incisum(A)and N.franchetii(B)

3.4 基于羌活化學(xué)成分的PCA分析

利用simca-p軟件包對不同產(chǎn)地羌活中羌活醇和異歐前胡素進行主成分(PCA)分析(圖7A)，發(fā)現(xiàn)四川的樣品主要集中在PCA三維圖的左下半部分，青海的樣品主要集中在左上半部分，并且比四川的樣品更為密集。這與采樣點的分布極為相似，根據(jù)不同產(chǎn)地之間成分的差異能很好的區(qū)分開來。四川產(chǎn)地的樣本主要集中在PC1的一側(cè)，說明其貢獻率在第一主成分比例很高，四川產(chǎn)羌活的羌活醇和異歐前胡素要高于青海省，驗證了其道地產(chǎn)區(qū)的特點。寬葉羌活化學(xué)成分含量PCA分析發(fā)現(xiàn)，四川的產(chǎn)地亦主要集中在PCA三維圖的左下半部分(圖7B)。甘肅的產(chǎn)地主要集中在左上半部分，與羌活產(chǎn)地的分布相類似，四川產(chǎn)地集中在第一主成分的一側(cè)，表明其含量要高于甘肅產(chǎn)地。

圖7 羌活(A)與寬葉羌活(B)化學(xué)成分含量主成分分析Fig.7 PCA for content of N.incisum(A)and N.franchetii(B)

4 討論

生態(tài)環(huán)境對中藥材的品質(zhì)有一定影響［16］。根據(jù)產(chǎn)地羌活可分為川羌和西羌［9］，川羌主產(chǎn)于四川省阿壩藏族自治州小金、松潘、甘孜藏族自治州。西羌主產(chǎn)于青海，甘肅等。化學(xué)成分含量測定結(jié)果表明羌活中羌活醇含量高于異歐前胡素，而寬葉羌活相反。兩種羌活的化學(xué)成分含量都以川羌最高。羌活化學(xué)成分與生態(tài)環(huán)境、地理分布密切相關(guān)，羌活藥材品質(zhì)是基于特有生態(tài)條件與栽培技術(shù)的綜合體現(xiàn)。諸如日照時數(shù)、年降水量、海拔有利于羌活中羌活醇含量的積累，而年降水量與海拔則不利于異歐前胡素含量的積累，從而影響藥材品質(zhì)。

4.1 活性成分與日照時數(shù)生態(tài)因子的關(guān)系

活性成分與日照時數(shù)均呈正相關(guān)關(guān)系。通過對圖4(A，C)比較發(fā)現(xiàn)，日照時數(shù)與羌活中羌活醇的正回歸系數(shù)大于異歐前胡素，而在圖5(A，C)寬葉羌活中，日照時數(shù)與羌活中羌活醇的正回歸系數(shù)小于異歐前胡素。羌活為短日照植物，怕強光，羌活與寬葉羌活對光照的適應(yīng)能力均較強，同一海拔地區(qū)的自然光強平均值介于21000—28000lx，羌活植株在該地區(qū)上方的光強平均介于1080—1320lx［17］，這與其在弱光的生長條件下相吻合。研究表明［18］，羌活的表觀量子率顯著高于寬葉羌活，說明羌活對弱光的利用能力強于寬葉羌活。羌活較寬葉羌活多生長在較高的海拔，其多分布在較為隱蔽和冰冷的生境中，而寬葉羌活生長在相對較為開闊、光照較好的灌叢或者針闊混交林一帶，即隱蔽的生境下弱光更弱，曝露的生境中強光更強。高海拔時羌活接受弱光日照時數(shù)長，羌活醇的積累高于異歐前胡素。而在相對海拔較低時，寬葉羌活接受強光日照時數(shù)長，異歐前胡素的富集高于羌活醇。羌活醇與異歐前胡素累積與光照強弱的相關(guān)性，有待進一步研究。

4.2 活性成分與年降水量、海拔生態(tài)因子的關(guān)系

通過圖5(A，C)比較發(fā)現(xiàn)，年降水量及海拔均能促進羌活及寬葉羌活中羌活醇含量積累，不利于異歐前胡素積累。羌活主要分布在高海拔地區(qū)(3700m以上)，降水多，有利于羌活醇含量積累。寬葉羌活則主要分布在1600m中海拔區(qū)，海拔、年降水量相對較低，有利于異歐前胡素的富集。四川為羌活道地產(chǎn)區(qū)，尤以小金、理縣、黑水、道孚、爐霍等縣較多，該地區(qū)屬亞熱帶氣候，高原地形，降水量大，空氣濕潤，季節(jié)變化及晝夜溫差大。適宜種植羌活。在川西高原川藏交界的一些河谷、甘南和青海等省的部分耕地充足，光熱條件優(yōu)越的低海拔地區(qū)適宜種植寬葉羌活。

綜上所述，本文首次應(yīng)用PLS，RDA雙序排序等方法分析了生態(tài)因子對含量的影響以及相關(guān)性。揭示了日照時數(shù)、年降水量及海拔對羌活、寬葉羌活中活性成分累積起重要作用。探討了弱光更利于羌活醇含量積累，強光適于異歐前胡素累積。在一定范圍內(nèi)，海拔越高，年降水量越大，越能促進羌活醇的積累，而不利于異歐前胡素含量富集。研究結(jié)果對保護瀕危高原藥用植物羌活、加強引種栽培及其資源可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

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