張 雁 韓毛振 羅學(xué)才 王晶晶

（1 合肥師范學(xué)院生命科學(xué)系，安徽 合肥 230061）

（2 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601）

大蹼鈴蟾（Bombina Maxima）隸屬無(wú)尾目（A-nura）、盤舌蟾科、鈴蟾屬，外形似蟾蜍，頭寬略大于頭長(zhǎng)；吻鈍圓，吻棱不顯；無(wú)鼓膜，無(wú)顳褶，舌近圓形，周圍與口腔粘膜相連；犁骨齒二短列，橫置內(nèi)鼻孔內(nèi)側(cè)后方。四肢粗壯，趾間全蹼或近全蹼，皮膚極粗糙，整個(gè)背面滿布大瘰粒，瘰粒之間及其上面滿布小刺，體側(cè)及四肢刺疣多。成體體長(zhǎng)60 mm左右。鈴蟾屬分布于歐洲到東亞一帶，是我國(guó)最原始的無(wú)尾目，有毒，腹部顏色鮮艷，遇到危險(xiǎn)時(shí)露出腹部的警戒色。在我國(guó)盤舌蟾科只有鈴蟾屬中的東方鈴蟾（BombinaBombina）、強(qiáng)刺鈴蟾（Bombinafortinuptialis）、微蹼鈴蟾（Bombinamicrodeladigitora）、大蹼鈴蟾（Bombina Maxima）四種鈴蟾分布。大蹼鈴蟾（Bombina Maxima）棲于海拔2500–3600m中高山環(huán)境中，國(guó)內(nèi)分布于四川、云南及貴州等地，在東南亞靠近云南的地區(qū)也有分布。

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化提供能量的場(chǎng)所[1]，是真核細(xì)胞內(nèi)的重要的細(xì)胞器。脊椎動(dòng)物線粒體DNA是一個(gè)環(huán)形雙鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)也有線性的，長(zhǎng)度約為 15-22kb[2，3]；線粒體 DNA 從硬骨魚類到哺乳動(dòng)物具有相對(duì)保守性[4]，由于其具有分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，呈母系遺傳，進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物遺傳學(xué)、分類學(xué)、疾病機(jī)理研究[5，6]及類群間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的研究。關(guān)于線粒體基因組的研究較多的集中在對(duì)于其蛋白編碼基因和rRNA基因的研究。對(duì)于線粒體基因組中的非編碼區(qū)（D-loop區(qū)）研究較少。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其非編碼區(qū)（D-loop區(qū)）包含重鏈的復(fù)制起始位點(diǎn)和3個(gè)保守區(qū)[7-9]，并發(fā)現(xiàn)在部分物種的非編碼區(qū)（D-loop區(qū)）中存在串聯(lián)重復(fù)序列。

本文采用LA-PCR、測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的方法，研究了大蹼鈴蟾的線粒體基因組的非編碼區(qū)域。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

PCR儀、超速冷凍離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、恒溫水浴鍋、移液槍、制冰機(jī)，超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、滅菌鍋、電子天平、純水儀等。

1.2 樣品來(lái)源和基因組DNA提取

成體大蹼鈴蟾（1♂），2004年采自云南玉龍雪山，標(biāo)本現(xiàn)-80℃保存?？侱NA采用Sambrook的方法[10]從肌肉組織中提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

綜合參考黑斑蛙（Rananigromaculata）、東方鈴蟾（Bombinaorientalis）的線粒體基因組全序列，先用CLUSTAL W1.8[11,12]比對(duì)同源區(qū)段，在D-loop區(qū)兩端的保守區(qū)段設(shè)計(jì)1對(duì)兼并引物，通過(guò)LA-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的序列。

圖1 大蹼鈴蟾線粒體基因組D-loop區(qū)LA-PCR結(jié)果

LA-PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：

94℃預(yù)變性 1min，97℃變性 10s，58℃退火15min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

取5μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用紫外觀察PCR產(chǎn)物擴(kuò)增情況，凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄結(jié)果。目的片段經(jīng)純化試劑盒 （V-gene DNA凝膠回收試劑盒）純化后，克隆到E.colipGEM-T載體中，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，菌液委托上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序（ABI 3730 DNA測(cè)序儀）。序列分析采用 BioEdit、DNASTAR（2001）軟件和測(cè)序峰圖結(jié)果分析進(jìn)行拼接，去除兩端多余序列最后得到大蹼鈴蟾的D-loop區(qū)完整基因序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蹼鈴蟾線粒體基因組D-loop區(qū)序列擴(kuò)增結(jié)果

大蹼鈴蟾線粒體包括D-loop區(qū)在內(nèi)的基因序列擴(kuò)增長(zhǎng)度約為3500 bp（圖1）。

2.2 大蹼鈴蟾線粒體基因組D-loop結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)對(duì)大蹼鈴蟾線粒體基因組D-loop區(qū)的測(cè)序和分析，去除兩端多余序列，得出大蹼鈴蟾的mtDNA中的D-loop區(qū)全長(zhǎng)2987bp，其中包括三個(gè)保守序列（CSB-1,CSB-2 and CSB-3）[13]，其結(jié)構(gòu)比較類似[14]。目前已知部分始蛙亞目在3`端有串聯(lián)重復(fù)序列。大蹼鈴蟾D-loop區(qū)的5`端和3`端各有明顯的串聯(lián)重復(fù)序列VNTR （a）和VNTR（b），因此造成其D-loop區(qū)長(zhǎng)度較一般始蛙亞目物種較長(zhǎng)。而除明顯的串聯(lián)重復(fù)序列（a）（b）外，大蹼鈴蟾的mtDNA的D-loop區(qū)VNTR（a）之后還有序列（5`-TAA-3`）重復(fù) 4 次，緊接著VNTR（b）有一個(gè)（5`-TGGTGGGGG-3`）的序列重復(fù)兩次，在這個(gè)重復(fù)序列之后就是tRNAPhe（圖2）。

圖2 大蹼鈴蟾D-loop區(qū)主要結(jié)構(gòu)特征

在大蹼鈴蟾D-loop區(qū)5`端有一段總長(zhǎng)989bp的重復(fù)序列（a），共重復(fù)了13次，將這13次重復(fù)的序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列大部分極其相似，但也有細(xì)微差別（圖3）。第一次重復(fù)的序列5`端有所差異，第13次重復(fù)的序列3`端缺少了一段，中間的重復(fù)序列第9次重復(fù)多了一段20bp的序列，其他的重復(fù)序列極其保守。

D-loop 3`端有一段總長(zhǎng)556bp的重復(fù)序列（b），為66bp左右的序列重復(fù)了9次，其中2、3段重復(fù)序列在順序上只有只有第38個(gè)堿基的差別，一個(gè)是堿基 C，一個(gè)是堿基 A；4、5、6、7、8 段的重復(fù)序列完全相同；其第1次重復(fù)的5`端有差異；第9次重復(fù)串聯(lián)重復(fù)序列的3`端的序列也是缺少了一段（圖4）。

圖4 大蹼鈴蟾D-loop區(qū)的3`端串聯(lián)重復(fù)序列（b）

3 討論

大蹼鈴蟾的mtDNA的D-loop區(qū)全長(zhǎng)2437bp，具有三個(gè)保守序列 （CSB-1，CSB-2 and CSB-3）。其5`端和3`端各有明顯的串聯(lián)重復(fù)序列。D-loop區(qū)因其調(diào)控整個(gè)mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,又稱為控制區(qū)，是線粒體全序列中變化最大的區(qū)域。物種和個(gè)體之間長(zhǎng)度的差異主要是由于串聯(lián)重復(fù)序列造成的。串聯(lián)重復(fù)序列多數(shù)位于中央控制區(qū)的兩側(cè)。這表明控制區(qū)易發(fā)生插入和缺失突變而其功能卻不受影響。線粒體基因組中重復(fù)序列的產(chǎn)生機(jī)制還沒(méi)有完全確定,一般認(rèn)為是復(fù)制滑脫和非同源性重組的結(jié)果[15-17]。新蛙亞目有很多物種D-loop很長(zhǎng)，尤其是在樹(shù)蛙科中：斑腿泛樹(shù)蛙（Polypedatesmegacephalus）2224bp，史立積綠樹(shù)蛙（Rhacophorusschlegelii）5659bp，卡吉卡蛙（Buergeriabuergeri）4575bp， 馬 達(dá) 加 斯 加 彩 蛙（Mantellamadagascariensis）6977bp。但是在始蛙亞目中，線粒體D-loop區(qū)一般在1000-2000bp左右，大蹼鈴蟾D-loop區(qū)與其他始蛙亞目相比較長(zhǎng)，這可能是因?yàn)槠?`端和3`端各有明顯的串聯(lián)重復(fù)序列，而大多數(shù)始蛙亞目只在3`端有明顯的串聯(lián)重復(fù)序列。

通過(guò)分析我們發(fā)現(xiàn)大蹼鈴蟾的這些串聯(lián)重復(fù)序列具有以下規(guī)律：

1.臨近的重復(fù)序列同源性較高，在（a）中，重復(fù)片斷（1 2 3）；（5 6 7）；（8 10 11 12）同源性很高，在重復(fù)序列（b）中（1 2 3）；（4 5 6 7 8）分別相似。

2.在整個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列中的處于5`和3`端的第一次和最后一次的重復(fù)序列片斷中往往不完整，第1次的重復(fù)序列的5`端常發(fā)生改變，最后一次的重復(fù)序列的重復(fù)序列往往發(fā)生缺失。

3.重復(fù)序列有時(shí)會(huì)插入一些片斷。在VNTR（a）中的第9次重復(fù)序列的中間就插入了一段長(zhǎng)19bp的序列。

4.重復(fù)片斷的差異是一種漸變的差異。

這些串聯(lián)重復(fù)序列表現(xiàn)出來(lái)的特征可能是復(fù)制滑脫和非同源性重組過(guò)程中產(chǎn)生的，對(duì)于分析線粒體基因組中重復(fù)序列的產(chǎn)生機(jī)制有十分重要的意義。

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