王曉佳，秦婷婷，胡 霞，胡 纖，黃銀春，張洪茂

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子與行為生態(tài)學(xué)研究組，武漢 430079)

復(fù)合不育劑EP-1對小鼠空間記憶與焦慮行為的影響

王曉佳，秦婷婷，胡 霞，胡 纖，黃銀春，張洪茂*

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子與行為生態(tài)學(xué)研究組，武漢 430079)

EP-1是由炔雌醚和左炔諾孕酮按照1∶2的比例配制而成的一種用于鼠類不育控制的激素類復(fù)合不育劑，對鼠類的繁殖及繁殖行為等有一定影響，但對鼠類空間學(xué)習與記憶、焦慮行為等非繁殖行為的影響還沒有報道。為此，用0 (對照)、1.0、2.0、3.0 mg/kg劑量的EP-1對昆明小鼠(Musmusculus)進行灌胃處理，然后用Morris水迷宮和高架十字迷宮分別測定其空間記憶、焦慮行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃后15 d，劑量為2.0 mg/kg的EP-1使小鼠空間記憶能力顯著下降，但30 d后其空間記憶能力有所恢復(fù)，表明2.0 mg/kg劑量的EP-1可以在一定時間范圍內(nèi)降低小鼠的空間記憶能力。但不同劑量的EP-1對小鼠焦慮行為無顯著影響。該結(jié)果可以為從對非繁殖行為的影響的角度研究EP-1對鼠類的作用提供一定啟示。

昆明小鼠(Musmusculus)；EP-1；空間記憶；焦慮

不育控制是借助某種技術(shù)和方法使雄性或雌性不育，或阻礙胚胎著床發(fā)育，甚至阻斷幼體生長發(fā)育，以降低鼠類的生育率，達到控制其種群數(shù)量和密度的目的，其本質(zhì)是生育控制[1- 2]。不育控制技術(shù)因其效果持久、生態(tài)安全等特點而備受關(guān)注[1,3]。

EP-1是由炔雌醚(quinestrol)和左炔諾孕酮(levonorgestrel)按照1∶2的比例配制，用于鼠類不育控制的激素類復(fù)合不育劑，能對多種鼠類的繁殖和繁殖行為產(chǎn)生不同程度的抑制作用[4]。例如EP-1可以降低布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)、灰倉鼠(Cricetulusmigratorius)和子午沙鼠(Merionesmeridianus)等鼠類的產(chǎn)仔率、產(chǎn)仔窩次數(shù)、胎仔數(shù)、延長產(chǎn)仔時間等[4]；可以有效降低大倉鼠(Tscherskiatriton)[5- 6]、黑線毛足鼠(Phodopuscampbelli)[7]、高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)[8]、長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)[9]等的種群繁殖力、種群數(shù)量，產(chǎn)生明顯的抗生育作用；此外EP-1還可以使雄性大倉鼠的繁殖器官明顯萎縮，變小[6]。但也有報道認為EP-1對雌性布氏田鼠的抗生育作用不明顯[10- 11]。然而，EP-1除了以生殖系統(tǒng)為作用靶標，直接影響鼠類與繁殖相關(guān)的生理過程和行為外，還可能影響非繁殖行為及其生理過程，例如空間記憶、焦慮等[12]，間接地影響鼠類的生存和繁殖，進而達到控制害鼠種群數(shù)量和密度的效果。空間記憶能力喪失或降低，過度焦慮等對人和鼠類的健康乃至生存具有重要影響[13- 14]。例如空間記憶能力減弱可能導(dǎo)致動物難以尋找食物和躲避危險而危及生存[15]；持續(xù)焦慮會引起人或動物行為異常、代謝紊亂而危及健康[16]。激素類藥物會影響鼠類空間記憶和焦慮已有少量報道，例如雙酚A(bisphenol A)可以降低雄性小鼠的空間學(xué)習與記憶能力，并且可以導(dǎo)致雄性小鼠的焦慮行為[12]；孕酮(progesterone)可以導(dǎo)致大鼠與小鼠在高架十字迷宮中的焦慮行為[17]。但尚無關(guān)于EP-1影響鼠類空間記憶和焦慮的報道，評估EP-1對鼠類的綜合作用效果時也常常忽略了EP-1對鼠類空間記憶、焦慮等非繁殖行為的影響。

為此，以小鼠在水迷宮(MWM)中的逃逸潛伏期、目標象限滯留時間、穿越逃逸平臺次數(shù)為空間記憶指標，以小鼠在高架十字迷宮(EPM)內(nèi)開臂進入次數(shù)和開臂滯留時間為焦慮行為指標，分別研究了不同劑量的EP-1在不同時間段對昆明小鼠(Musmusculus)空間記憶和焦慮的影響，以探索EP-1能否對鼠類的空間記憶及焦慮產(chǎn)生影響，為從對非繁殖行為影響的角度研究和評估EP-1對鼠類的作用提供一定啟示和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗鼠及分組

1.2 實驗過程

按照1∶2的比例將炔雌醚和左炔諾孕酮溶解于花生油(魯花牌)中，分別配制成1.0、2.0、3.0 mg/mL的EP-1溶液，并以花生油為對照。每天18:00—19:00用小鼠灌胃器(zc14000, 武漢博馳生物科技有限公司)對各組小鼠灌胃，連續(xù)給藥15 d，每5 d測定一次小鼠體重。給藥結(jié)束后以正常飼料飼養(yǎng)。

Morris水迷宮(MWM)實驗:該實驗分別在給藥結(jié)束后15 d與30 d各進行1次，每次連續(xù)訓(xùn)練5d。以經(jīng)典Morris準則使用MWM測定空間學(xué)習與記憶[18]。MWM(DB001, 淮北正華生物儀器有限公司)由黑色圓柱形恒溫游泳水池(直徑120 cm, 高40 cm)，黑色隱藏平臺(直徑8 cm，高21 cm)及攝像與記錄系統(tǒng)組成，置于控溫房間內(nèi)，并用黑色不透光布簾罩住，以保證穩(wěn)定的測試環(huán)境和避免實驗鼠利用其它的空間記憶線索。實驗時在水池四周做4個迷宮標記，將水池分為4個象限，隱藏平臺所在的區(qū)域為目標象限，水深22 cm，水溫(22±1) ℃。實驗開始時，將小鼠頭面對水池墻壁上的標記，由任一象限入水，并利用攝像系統(tǒng)記錄小鼠對隱藏平臺的尋找。設(shè)定找尋時間60 s，小鼠在60 s內(nèi)找到隱藏平臺并滯留3 s及以上，視為逃逸成功，從動物入水至逃逸成功所用時間記為逃逸潛伏期。如果小鼠60 s內(nèi)未找到隱藏平臺(未成功逃逸)，則由實驗者將其引導(dǎo)至隱藏平臺上適應(yīng)30 s，以幫助小鼠學(xué)習，逃逸潛伏期記為60 s。每只小鼠分別在四個象限連續(xù)訓(xùn)練5 d。用逃逸潛伏期表示小鼠的學(xué)習能力。然后撤去平臺，在任意一非目標象限放入小鼠，記錄其目標象限滯留時間和穿越隱藏平臺次數(shù)，以測試其空間記憶(尋找隱藏平臺)能力。

高架十字迷宮(EPM)測試:該實驗在水迷宮實驗完成后第2天進行。EPM測試是研究嚙齒類動物焦慮的經(jīng)典試驗方法[17]。EPM(XR-XG201, 武漢一鴻科技有限公司)“十”型平臺距離地面50 cm，由兩條相對開臂(50 cm長×10 cm寬)和兩條相對閉合臂(50 cm長×10 cm寬×40 cm高)及中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)組成，置于暗室內(nèi)(80 lx)。實驗開始時，將動物背對實驗者面對開臂放入迷宮中央?yún)^(qū)，隨后5min內(nèi)用攝像機記錄小鼠在迷宮里的活動情況。為了消除不同次測試間的相互影響，每次測試結(jié)束后立即清除小鼠糞便，用醫(yī)用酒精(75%濃度)擦洗迷宮，并閑置30min待酒精揮發(fā)后再進行下一次測試。用ANY-MAZE軟件分析動物開臂進入次數(shù)和開臂滯留時間，以此反映實驗動物的焦慮狀態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。用Mann-Whitney U Test分別對水迷宮實驗中逃逸潛伏期，目標象限滯留時間、平均穿越平臺次數(shù)，以及對高架十字迷宮實驗中開臂進入次數(shù)、開臂滯留時間進行各實驗組與對照組之間的兩兩比較。

2 結(jié)果

Morris水迷宮測定結(jié)果顯示，經(jīng)過5 d尋找隱藏平臺訓(xùn)練，四組小鼠的逃逸潛伏期迅速下降，到第5天時達較精準水平。給藥后15 d，與對照組相比，各處理組鼠的逃逸潛伏期較對照組延長，但1.0 mg/kg組、3.0 mg/kg組無顯著性差異，2.0 mg/kg組在水迷宮訓(xùn)練的第5天 (Z= -2.893,P= 0.004)有極顯著性差異(圖1)。給藥后30 d，各處理組鼠的逃逸潛伏期較對照組延長，水迷宮訓(xùn)練的第1天 1.0 mg/kg組(Z= -2.463,P= 0.014), 2.0 mg/kg組(Z= -2.163,P= 0.031)小鼠差異顯著，但第2天，第3天，第4天，第5天無顯著差異(圖1)。

圖1 不同劑量EP-1灌胃后15 d、30 d小鼠在水迷宮內(nèi)的逃逸潛伏期Fig. 1 Escape latency of Mus musculus within Morris water maze at 15 d and 30 d after EP-1 gastrogavage平均數(shù)±標準誤; * (P lt; 0.05), ** (P lt; 0.01)表示與對照組差異顯著

給藥后15 d，2.0 mg/kg組(Z= -2.911,P= 0.004)和3.0 mg/kg組(Z= -2.654,P= 0.008)小鼠在目標象限內(nèi)的滯留時間較對照組顯著減少；給藥后30 d，處理組小鼠在目標象限內(nèi)的滯留時間較對照組無顯著差異(圖2)。與對照組相比，給藥后15 d, 2.0 mg/kg組平均穿越平臺的次數(shù)顯著減少(Z= -2.459,P=0.014)，1.0 mg/kg組、3.0 mg/kg組無顯著差異；給藥后30 d，各組平均穿越平臺次數(shù)較對照組均無顯著差異(圖2)。

圖2 不同劑量EP-1灌胃后15 d、30 d小鼠在水迷宮內(nèi)目標象限滯留時間和平均穿越平臺次數(shù)Fig. 2 Retention time and frequency in crossing the hidden platform of Mus musculus in the target quadrant of Morris water maze at 15 d and 30 d after EP-1 gastrogavage平均數(shù)±標準誤; * (P lt; 0.05), ** (P lt; 0.01)表示與對照組差異顯著

高架十字迷宮測定結(jié)果顯示，給藥后15 d，30 d各處理組小鼠開臂滯留時間、開臂進入次數(shù)較對照組均無顯著差異(Pgt; 0.05, 圖3)。

在班級管理過程中，評優(yōu)是對學(xué)生積極性的激發(fā)，是對學(xué)生努力成果的肯定，讓學(xué)生樹立自信，完善他們的人格，對學(xué)生今后的發(fā)展有著深遠的意義。結(jié)果是一件事情發(fā)展到最后的成果，而過程是結(jié)果的前提，沒有過程就沒有一個完美的結(jié)果，不注重過程不會體會到成長的艱辛和樂趣，因此，評優(yōu)推先要重視過程，認真對照過程記錄，關(guān)注學(xué)生的習慣養(yǎng)成，讓優(yōu)秀者名副其實，真正擁有榜樣作用；讓落評者從成長過程中找出不足，通過努力，追趕先進，最終形成你追我趕，擁有正能量的班集體。

圖3 不同劑量EP-1灌胃后第15天、30天小鼠在高架十字迷宮內(nèi)開臂滯留時間和開臂進入次數(shù)Fig.3 Time spent in open arms and entries into open arms of Mus musculus in the elevated plus maze at 15 d and 30 d after EP-1 gastrogavage平均數(shù)±標準誤

3 討論

結(jié)果表明EP-1處理可以在一定時間內(nèi)(15 d)導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習記憶能力下降。動物表現(xiàn)為尋找隱藏平臺的潛伏期顯著延長，當平臺撤去時動物在隱藏平臺所在象限滯留時間和穿越隱藏平臺次數(shù)明顯減少。該結(jié)果與Ryu 等關(guān)于動物在應(yīng)對外界壓力時可能出現(xiàn)認知缺陷，導(dǎo)致空間記憶能力下降的研究結(jié)果類似[19]。但田棟等研究表明雙酚A對雌性小鼠的空間記憶能力影響不顯著[12]，這可能是不同激素的差異所致。經(jīng)過一段時間(30 d)后，小鼠的空間學(xué)習記憶能力有所恢復(fù)，表現(xiàn)為隨著EP-1作用時間延長，處理組與對照組小鼠之間逃逸潛伏期的差異性減小，目標象限滯留時間和隱藏平臺穿越次數(shù)整體降低，處理組與對照組之間差異不明顯，表明EP-1對小鼠空間學(xué)習記憶能力的影響可能具有可逆性。沈偉等也曾報道炔雌醚對雄性長爪沙鼠生殖器官和繁殖的影響具有可逆性[20]，表明EP-1對鼠類繁殖行為與非繁殖行為的影響可能在一定程度上都具有可逆性。與對照組相比，處理組小鼠尋找隱藏平臺潛伏期延長、在目標象限滯留時間縮短、穿越原平臺次數(shù)減少，表明EP-1處理可能在一定程度上導(dǎo)致小鼠的認知障礙，降低其空間學(xué)習記憶能力，進而可能影響小鼠的生存[15]。自然條件下，空間記憶能力下降或喪失會危及鼠類生存和繁殖，從而可能降低種群密度，達到控制害鼠的目的[21- 22]。例如，分散貯藏食物的鳥類和鼠類，很大程度上依靠空間記憶找回食物以度過食物短缺期，空間記憶下降或喪失，貯食動物將無法找回貯藏食物而危及生存和繁殖，導(dǎo)致種群數(shù)量下降[21- 22]。因此，該結(jié)果可能為從“降低空間記憶、影響生存與繁殖、降低種群密度，有效防控鼠害”的角度探索EP-1對鼠類的影響提供一些啟示和思考方向。

Spielberge 等將焦慮分為特質(zhì)焦慮和狀態(tài)焦慮，特質(zhì)焦慮是相對持久的、焦慮傾向相對穩(wěn)定的、個體差異明顯的焦慮；而狀態(tài)焦慮則是指焦慮的暫時波動狀態(tài)，是由特定的情境引起的[23]。本文實驗結(jié)果表明EP-1處理對小鼠焦慮反應(yīng)無顯著影響，表現(xiàn)為EP-1處理小鼠和對照組在高架十字迷宮內(nèi)開臂進入次數(shù)和開臂滯留時間無顯著差異。關(guān)于激素與鼠類焦慮的關(guān)系已有少量研究結(jié)果，例如雙酚A可使雄性小鼠焦慮，而使雌性小鼠的焦慮有所緩解[12]；孕酮(progesterone)可以導(dǎo)致大鼠與小鼠焦慮行為等[17]，但尚無EP-1影響鼠類焦慮行為的報道。 EP-1可能導(dǎo)致不同鼠類體重減輕，生殖器官萎縮、繁殖行為弱化、繁殖能力下降等[5- 9]。室內(nèi)觀察結(jié)果也表明，EP-1處理會導(dǎo)致小鼠食量減少、體重減輕、胚胎死亡、親體撫育行為減弱及殺嬰等(王曉佳等，未發(fā)表)。這些結(jié)果表明，EP-1會導(dǎo)致小鼠身體條件下降，對環(huán)境壓力的反應(yīng)可能增強，進而產(chǎn)生不同程度的焦慮反應(yīng)。該種焦慮反應(yīng)可能屬于Spielberge 等定義的狀態(tài)焦慮，會隨著不同的情景條件而變化，具有短暫性和波動性[23]。測試的時間可能錯過了由EP-1引起的小鼠焦慮反應(yīng)時期，結(jié)果難以否定EP-1刺激小鼠及其它鼠種焦慮反應(yīng)的可能性，因此這方面還需要繼續(xù)研究。

結(jié)果表明EP-1在一定時間內(nèi)可以導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習記憶能力下降。這可能是EP-1直接作用的結(jié)果，也可能是EP-1作用于鼠類繁殖和繁殖過程的行為表現(xiàn)，類似藥物反應(yīng)副作用。由于個體差異較大，數(shù)據(jù)的標準誤差也較大，意味著測試存在較大的差異區(qū)間及不同劑量間的重疊，導(dǎo)致結(jié)果具有一定的不確定性。同時，測試限于給藥后15 d和30 d，時間間隔有一定隨意性，結(jié)果體現(xiàn)了兩個時間點EP-1處理和對照間的差異，但難以反映整個給藥過程(30 d) 的行為變化。因此，結(jié)論尚需在更精確的實驗條件下加以驗證。但作為新探索之一，該實驗的思路和結(jié)果在探索EP-1對鼠類非繁殖行為的影響方面還是具有某些啟示和借鑒意義。野外條件下，空間學(xué)習記憶能力下降會影響鼠類的生存和繁殖，導(dǎo)致種群下降，達到鼠害防控的目的。因此該結(jié)果也可以為從EP-1導(dǎo)致空間記憶能力下降進而危及生存和繁殖的角度探索EP-1對野生鼠的效用提供一定啟示。

致謝:感謝華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廖曉梅博士為水迷宮、高架十字迷宮測試提供的幫助。

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EffectsofEP-1onspatialmemoryandanxietyinMusmusculus

WANG Xiaojia, QIN Tingting, HU Xia, HU Qian, HUANG Yinchun, ZHANG Hongmao*

MolecularandBehaviouralEcologyGroup,CollegeofLifeSciences,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China

It has been reported that the EP-1, a contraceptive compound composed of levonorgestrel and quinestrol with the ratio of 1∶2, has negative effects on the breeding and reproductive behaviors in some species of mice and rats. However, little is known that the effects of EP-1 on spatial memory and anxiety in mice. Here, the effects of treatment time (15 d and 30 d) and dose (0 mg/kg (control), 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg) of EP-1 on spatial memory and anxiety inMusmusculuswere tested using Morris water maze and elevated plus maze separately. Negative effects of 2.0 mg/kg EP-1 on spatial memory of the subjects were found in 15 days, and this ability recovered in 30 days, implying the 2.0 mg/kg EP-1 can decrease the ability of spatial memory ofM.musculuswithin a period of time. No significant effects were found in all treatments of time and dose of EP-1 on anxiety of the subjects. The results might help to evaluate the effects of EP-1 on mice in respect to non-reproductive behaviors.

anxiety; EP-1;Musmusculus; spatial memory

2012- 06- 09;

2012- 11- 19

*通訊作者Corresponding author.E-mail: hongmaozhang@gmail.com

10.5846/stxb201206090829

王曉佳，秦婷婷，胡霞，胡纖，黃銀春，張洪茂.復(fù)合不育劑EP-1對小鼠空間記憶與焦慮行為的影響.生態(tài)學(xué)報,2013,33(17):5228- 5233.

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