楊 凱，管世鶴，王愛(ài)華，潘 穎，吳園園，孫蓓蓓

乙型肝炎是危害人類(lèi)健康的重要疾病之一，且隨著時(shí)間進(jìn)程可能會(huì)發(fā)展為慢性乙肝、肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌［1］。IFN-α和拉米夫定是臨床上兩種重要的抗HBV藥物。其中，IFN-α是一種細(xì)胞因子，能夠通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)抗病毒蛋白:如雙鏈RNA激活的蛋白激酶(PKR)、2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2'，5'-OAS)、抗粘液病毒 A蛋白(MxA)、抗粘液病毒B蛋白(MxB)，進(jìn)而發(fā)揮抗HBV活性;抗病毒核苷類(lèi)似物拉米夫定主要抑制HBV多聚酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，從而有效阻止病毒核酸的復(fù)制合成［2－3］。有學(xué)者研究報(bào)道顯示，拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫治療慢性乙型肝炎療效明顯優(yōu)越于IFN-α單獨(dú)治療［4］。此外，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中拉米夫定聯(lián)合 IFN-α序貫處理HepG2.2.15細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的HBV復(fù)制明顯減少，而IFN-α單獨(dú)處理對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制沒(méi)有明顯影響，但相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制尚未闡明［5］。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析比較IFN-α單獨(dú)處理和拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫處理對(duì)人肝胚瘤細(xì)胞株HepG2.2.15表達(dá)干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITM1、IFITM2、IFITM3)的影響，研究拉米夫定與IFN-α序貫處理的抗HBV機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 轉(zhuǎn)染試劑盒脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司。IFN-α1b購(gòu)自深圳科興生物工程有限公司?？?IFITM1、IFITM2、IFITM3購(gòu)自Santa Cruz公司。二抗購(gòu)自中杉金橋公司。質(zhì)粒pEGFP-N1購(gòu)自 Invitrogen公司。質(zhì)粒 pEGFP-IFITM1和HepG2.2.15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 質(zhì)粒的提取及酶切鑒定 分別搖含有質(zhì)粒pEGFP-N1、pEGFP-IFITM1 菌液各 300 ml，采用 Pure YieldTMplasmid Midiprep System試劑盒，提取過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，質(zhì)粒 pEGFP-IFITM1采用EcoR I、BamHⅠ雙酶切鑒定。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理 HepG2.2.15細(xì)胞以DMEM 培養(yǎng)，并補(bǔ)充2 mmol·L－1谷氨酰胺、50 kU·L－1青霉素、50 mg·L－1鏈霉素、500 mg·L－1G418、5%(vol/vol)FCS，于 5%CO2條件下 37℃孵育箱培養(yǎng)。HepG2.2.15細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%小牛血清、100 kU·L－1青霉素、100 kU·L－1鏈霉素、2 mmol·L－1谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到約40% ～50%融合時(shí)，以0～1 000 kU·L－1IFN-α連續(xù)處理 HepG2.2.15細(xì)胞為 IFN-α 單獨(dú)處理組，以20 μmol·L－1拉米夫定聯(lián)合0 ～1 000 kU·L－1IFN-α 處理的 HepG2.2.15 細(xì)胞為序貫處理組。轉(zhuǎn)染前1 d行HepG2.2.15 細(xì)胞傳代，并以5 ×107·L－1接種6孔板。接種后d 2待細(xì)胞匯合約為75%時(shí)按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟分別將質(zhì)粒pEGFP-N1和pEGFP-IFITM1 與 LipofectamineTM2000 250 μl混勻至無(wú)血清DMEM行轉(zhuǎn)染，其中HepG2.2.15細(xì)胞不做任何處理為未轉(zhuǎn)染組，HepG2.2.15細(xì)胞按上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1為空載體組，HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)IFITM1蛋白的質(zhì)粒 pEGFP-IFITM1為轉(zhuǎn)染組。

1.4 免疫印跡技術(shù)分析 6孔板中細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗3次，每孔加80 μl含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上反應(yīng) 10 min，振蕩，12 000 r·min－1，4℃離心10 min，收集上清液與20 μl蛋白上樣緩沖液混合煮沸10 min。取20 μl行SDS-PAGE電泳，80 mA電流2 h濕電轉(zhuǎn)，10%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，加一抗過(guò)夜，PBS洗3次;加二抗室溫孵育2 h，PBS漂洗3次，ECL試劑盒檢測(cè)。

1.5 Southern blot技術(shù)分析 收集處理的HepG2.2.15 細(xì)胞，用裂解液Ⅱ (50 mmol·L－1Tris-Cl，pH 7.4，150 mmol·L－1NaCl，5 mmol·L－1MgCl2，0.5%NP-40)室溫裂解 5 ～10 min;離心，分離胞漿制備物并以DNA酶(DNase I，Roche，Germany)消化未受保護(hù)的DNA。用 SDS、NaCl和蛋白酶K(proteinase K，QIAGEN)進(jìn)行序列處理，再用酚/氯仿(1∶1，vol/vol)、氯仿抽提懸浮液，異丙醇沉淀HBV復(fù)制中間體DNA(RI)。將20 μg含HBV復(fù)制中間體DNA的胞漿制備物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到Hybond-N+陽(yáng)離子尼龍膜上，經(jīng)干燥、變性、中和后與32P標(biāo)記的HBV DNA探針雜交。1.6 ELISA分析細(xì)胞外HBV抗原 分別收集不同濃度和不同處理時(shí)期的培養(yǎng)上清液，按1 200 r·min－1離心10 min以去除細(xì)胞碎片，于－20℃保存上清。將收集的條件上清液用ELISA法按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)HBsAg和HBeAg，讀取450 nm波長(zhǎng)吸光度值并計(jì)算出HBsAg和HBeAg量。

2 結(jié)果

2.1 IFN-α單獨(dú)處理 HepG2.2.15 細(xì)胞后干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白的表達(dá) 免疫印跡技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，IFN-α連續(xù)處理 HepG2.2.15 細(xì)胞 12 h 后，隨著IFN-α濃度的上升，干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白IFITM1在HepG2.2.15細(xì)胞的表達(dá)逐漸上升，表達(dá)量分別為0.28±0.08、0.44±0.10、1.16±0.21;IFITM2表達(dá)量為 0.56±0.11、0.71±0.07、1.56±0.20;IFITM3表達(dá)量為0.14±0.06、0.22±0.08、0.35±0.11。見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Expression of IFITM1，IFITM2 and IFITM3 proteinin HepG2.2.15 cells treated with different concentrations of IFN-α

2.2 拉米夫定聯(lián)合 IFN-α序貫處理 HepG2.2.15細(xì)胞后抗病毒蛋白的表達(dá) 免疫印跡技術(shù)分析提示20 μmol·L－1拉米夫定處理 HepG2.2.15 細(xì)胞 7 d，再分別補(bǔ)充 0、500、1 000 kU·L－1IFN-α 序貫處理細(xì)胞后，IFITM2表達(dá)量為0.31±0.20、0.69±0.12、1.61±0.23，IFITM3表達(dá)量為0.15±0.09、0.21±0.10、0.37±0.13，IFITM2和 IFITM3 無(wú)變化，而 IFITM1表達(dá)量為 0.46±0.09、0.75±0.08、2.07±0.22，在HepG2.2.15細(xì)胞的表達(dá)增高。見(jiàn) Fig 2。

Fig 2 Expression of IFITM1，IFITM2 and IFITM3 protein in HepG2.2.15 cells treated with 20 μmol·L －1lamivudine and different concentrations of IFN-α

2.3 IFN-α單獨(dú)處理和拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫處理對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi) HBV復(fù)制的影響

Southern blot分析提示，分別采用單獨(dú)IFN-α和拉米夫定聯(lián)合 IFN-α序貫處理HepG2.2.15細(xì)胞時(shí)，單獨(dú)IFN-α對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV DNA無(wú)明顯影響;1 000 kU·L－1IFN-α與拉米夫定聯(lián)合處理3 d后，細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA完全消失。見(jiàn)Fig 3。

2.4 抗病毒蛋白 IFITM1對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV的影響 抗病毒蛋白IFITM1轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞24～72 h后，細(xì)胞上清液中HBsAg的S/CO值為0.31±0.15、1.18±0.27和1.62±0.12，其中轉(zhuǎn)染48 h與72 h細(xì)胞上清液中HBsAg的S/CO值明顯高于轉(zhuǎn)染24h，P均＜0.05;HBeAg的S/CO值為1.91±0.20、1.78±0.23和2.35±0.21。IFITM1轉(zhuǎn)染組HBV抗原的S/CO值與空白對(duì)照組細(xì)胞上清液中HBsAg的S/CO值(0.33±0.12、1.79±0.14、

Fig 3 Effect of IFN-α or sequentially treated with lamivudine and IFN-α on the extracellular HBV DNA in HepG2.2.15 cells

3.05±0.24)和 HBeAg的 S/CO值(1.82±0.27、2.42±0.39、4.01±0.17)相比較，轉(zhuǎn)染48、72 h后，兩組細(xì)胞上清液中HBV抗原的S/CO值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均＜0.05。但I(xiàn)FITM1蛋白對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV DNA無(wú)影響，直至72 h。見(jiàn) Tab 1、2。

Tab 1 Effect of IFITM1 on the extracellular HBsAg in HepG2.2.15 cells(ˉ±s，n=8)

Tab 1 Effect of IFITM1 on the extracellular HBsAg in HepG2.2.15 cells(ˉ±s，n=8)

*P ＜0.05 vs untransfected group and empty vector group

Group The S/CO ratio of HBsAg 24 h 48 h 72 h Untransfected 0.33 ±0.12 1.79 ±0.14 3.05 ±0.24 Empty vector 0.29 ± .014 1.72 ±0.11 3.11 ±0.20 Transfection 0.31 ±0.15 1.18 ±0.27* 1.62 ±0.12*

Tab 2 Effect of IFITM1 on the extracellular HBeAg in HepG2.2.15 cells(ˉ±s，n=8)

Tab 2 Effect of IFITM1 on the extracellular HBeAg in HepG2.2.15 cells(ˉ±s，n=8)

*P＜0.05 vs untransfected group and empty vector group

Group The S/CO ratio of HBeAg 24 h 48 h 72 h Untransfected 1.82 ±0.27 2.42 ±0.39 4.01 ±0.17 Empty vector 1.76 ±0.32 2.51 ±0.33 4.2 ±0.12 Transfection 1.91 ±0.20 1.78 ±0.23* 2.35 ±0.21*

3 討論

抗病毒治療是臨床上慢性乙型肝炎治療的關(guān)鍵，通過(guò)清除或持續(xù)抑制HBV復(fù)制，從而降低HBV致病性和減輕肝臟炎癥反應(yīng)［6］。目前，公認(rèn)有效的抗HBV藥物主要有IFN-α和核苷酸類(lèi)似物拉米夫定，兩種藥物具有不同的抗HBV機(jī)制。IFN-α通過(guò)激活細(xì)胞JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑編碼合成諸多抗病毒蛋白表達(dá)，抑制病毒復(fù)制，而拉米夫定發(fā)揮抗HBV作用的靶位點(diǎn)是HBV逆轉(zhuǎn)錄酶。臨床研究表明，慢性乙型肝炎患者單獨(dú)IFN-α抗病毒治療的完全應(yīng)答率不高，然而，經(jīng)拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫治療后能夠明顯提高IFN-α抗HBV療效。在體外實(shí)驗(yàn)中，拉米夫定聯(lián)合 IFN-α序貫處理能夠抑制HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)的 HBV 復(fù)制，而單獨(dú) IFN-α 對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制沒(méi)有明顯影響。據(jù)此，我們推測(cè)拉米夫定聯(lián)合IFN-α可能通過(guò)影響IFN-α抗病毒蛋白的表達(dá)而提高IFN-α抗病毒療效。

本研究發(fā)現(xiàn)，HepG2.2.15細(xì)胞分別經(jīng) IFN-α單獨(dú)處理和拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫處理后，細(xì)胞內(nèi)干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITM1、IFITM2、IFITM3)的表達(dá)和病毒復(fù)制具有一定差異。其中，干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白IFITM1隨著IFN-α濃度的增加，在序貫處理組HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)逐漸增高，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制明顯減少。然而，在IFN-α單獨(dú)處理組并未出現(xiàn)IFITM1的表達(dá)隨著IFN-α濃度的增加而增加和病毒復(fù)制減少，這表明拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫處理可能通過(guò)上調(diào)IFITM1的表達(dá)進(jìn)而抑制HBV復(fù)制。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染我們還發(fā)現(xiàn)，IFITM1在HepG2.2.15中能夠抑制HBV蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)出一定抗HBV活性，這也進(jìn)一步證實(shí)拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫治療能夠提高IFN-α抗HBV活性。

總之，本研究初步探討了拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫治療抗HBV機(jī)制，并認(rèn)為拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫處理增強(qiáng)IFN-α誘導(dǎo)HepG2.2.15表達(dá)干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白IFITM1，這可能是臨床上拉米夫定聯(lián)合IFN-α序貫治療慢性乙型肝炎重要機(jī)制之一，并為提高IFN-α抗病毒療效提供新策略。

［1］ 管世鶴，潘 穎，楊 凱，等.HBx蛋白對(duì)α干擾素誘導(dǎo)的MxA蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(6):797－800.

［1］ Guan S H，Pan Y，Yang K，et al.Effects of hepatitis B virus X protein on the expression of interferon-induced MxA protein ［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(6):797 －800.

［2］ Niro G A，Ippolito A M，F(xiàn)ontana R，et al.Long-term outcome of hepatitis B virus-related chronic hepatitis under protracted nucleos(t)ide analogues［J］.J Viral Hepat，2013，20(7):502 －9.

［3］ 管世鶴，楊 凱，陸蒙吉，等.乙型肝炎病毒及其抗原成分對(duì)干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分子和抗病毒蛋白的影響［J］.中華肝臟病雜志，2011，19(6):440 －4.

［3］ Guan S H，Yang K，Lu M J，et al.The influence of HBV and its antigens on the expressions of JAK-STAT signal transduction pathway molecules and antiviral proteins of IFN alpha［J］.Chin J Hepatol，2011，19(6):440 －4.

［4］ 楊 京，張莉莎，趙雪珂.單用或聯(lián)合應(yīng)用拉米夫定和干擾素-α1b對(duì)乙型肝炎血清標(biāo)志物的影響［J］.中華肝臟病雜志，2003，11(2):109－10.

［4］ Yan J，Zhang L S，Zhao X K.Effect of single-using or combinedusing lamivudine/interferon-alpha 1b on serum markers in patients with hepatitis B［J］.Chin J Hepatol，2003，11(2):109 － 10.

［5］ Guan S H，Lu M，Grünewald P，et al.Interferon-alpha response in chronic hepatitis B-transfected HepG2.2.15 cells is partially restored by lamivudine treatment［J］.World J Gastroenterol，2007，13(2):228－35.

［6］ 王魯文，龔作炯.STAT-1分子在干擾素治療慢性乙型肝炎不同應(yīng)答者肝組織中的表達(dá)［J］.中華臨床感染病雜志，2008，1(2):77－9.

［6］ Wang L W，Gong Z J.Expression of signal transduction molecule STAT-1 in patients with chronic hepatitis B after interferon-alpha therapy［J］.Chin J Clin Infect Dis，2008，1(2):77 －9.