侯 微，袁恒杰，溫 克，吳艷娜，婁建石

肢體缺血預適應(limb ischemic preconditioning，LIP)是指反復短暫的肢體缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)對其他組織器官(如心臟、腦等［1－5］)的長時間I/R損傷具有保護作用。與心臟原位缺血預適應比較，LIP具有方便可行的優(yōu)勢，具有更大的臨床應用價值。本實驗室前期研究表明，連續(xù)3 d的LIP可提供與心臟原位缺血預適應強度相當?shù)谋Ｗo作用［6］，且能改善長時間心肌I/R造成纖溶系統(tǒng)失衡狀態(tài)。本研究探討LIP對凝血功能的影響，以及線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP)在 LIP心臟保護中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康♂ Wistar大鼠56只，體質(zhì)量240～270 g〔二級，實驗動物質(zhì)量合格證許可證號:SCXK(京)2007-0001〕，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 5-羥基癸酸鈉(5-hydroxydecanoate，5-HD)，BioMol，美國;活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)測定試劑盒，天津美德太平洋科技有限公司;凝血酶原時間(prothrombin time，PT)測定試劑盒，Instrumentation Laboratory Company;纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)測定試劑盒，F(xiàn)isher Scientific Company L.L.C;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，Sigma;原位細胞凋亡檢測試劑盒，Roehe;BP-動物無創(chuàng)血壓測定儀、BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)、HX-300動物呼吸機，成都泰盟科技有限公司;CA-7000全自動血液分析儀，Sysmex;2050型自動石蠟切片機，Leica，德國;Bx50F4型光學顯微鏡，Olympus，日本;HIl220型切片烘干機，Leica，德國。

1.3 模型制備［7］

1.3.1 心肌I/R損傷模型 大鼠以25%烏拉坦(1 g·kg－1)腹腔注射麻醉，連續(xù)監(jiān)測標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖和血壓。開胸，在冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)下穿線，絲線兩端共同穿過一末端為球形的聚乙烯小管，形成一活結(jié)。拉緊活結(jié)造成LAD供血區(qū)心肌缺血，放松活結(jié)使心肌恢復血流灌注。大鼠行LAD結(jié)扎30 min缺血，繼之120 min再灌注。

1.3.2 無創(chuàng)肢體缺血預適應模型 大鼠以1%戊巴比妥鈉(30 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，將改良的動物無創(chuàng)血壓測試儀自制套管置于大鼠左后肢根部，脈搏傳感器緊貼在足背動脈上，應用動物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)，連續(xù)監(jiān)測血壓和脈搏。加壓，以脈搏消失、肢體遠端體溫下降、皮膚發(fā)紺為阻斷股動脈標志，持續(xù)5 min;減壓，以脈搏出現(xiàn)、肢體遠端體溫回升、皮膚潮紅為再灌注標志，持續(xù)5 min，重復3個循環(huán)為1次LIP。每天1次，連續(xù)3 d。

1.4 實驗分組 健康♂ Wistar大鼠56只，隨機分為4組。

1.4.1 I/R組(n=14) 大鼠連續(xù)3 d腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg－1)。d 4，LAD 經(jīng)歷30 min 缺血/120 min再灌注。于30 min缺血前10 min股靜脈注射與藥物等體積的生理鹽水(normal saline，NS)，并于I/R期間用注射泵恒速靜脈輸入與藥物等體積的NS。

1.4.2 I/R+5-HD 組(n=14)I/R 損傷模型大鼠于d 4 30 min缺血前10 min股靜脈注射5-HD溶液9 mg·kg－1。并于I/R期間用注射泵恒速靜脈輸入5-HD溶液1 mg·kg－1。余同I/R組。

1.4.3 LIP組(n=14)LIP模型大鼠每天經(jīng)歷3次左后肢5 min缺血/5 min再灌注，連續(xù)3 d。d 4對心臟LAD實施30 min缺血/120 min再灌注。余同I/R組。

1.4.4 LIP+5-HD 組(n=14)LIP 模型大鼠每天經(jīng)歷3次左后肢5 min缺血/5 min再灌注，連續(xù)3 d。d 4對心臟LAD實施30 min缺血/120 min再灌注。余同I/R+5-HD組。

1.5 檢測指標

1.5.1 血壓與心率 在大鼠LAD結(jié)扎前、LAD結(jié)扎立即、15和30 min以及再灌30、120 min記錄收縮壓、舒張壓和心率，并計算平均動脈壓。

1.5.2 心肌梗死面積 于再灌注120 min末立即結(jié)扎LAD，股靜脈注射0.6%臺盼藍2 ml。迅速取下心臟，洗凈殘血，－20℃冰箱冷凍20 min。由心尖部向心基部將心臟切成1mm厚切片，未被藍染的為危險區(qū)(area at risk，AAR)，將其進行1%TTC染色20 min，瀕死區(qū)心肌組織被染為磚紅色，梗死區(qū)(infarct size，IS)為灰白色，用10%福爾馬林溶液固定標本，將IS從AAR中分離出來，電子天平稱重，以IS占AAR重量的百分比(IS/AAR%)計算梗死面積。

1.5.3 心肌細胞凋亡 于再灌注120 min末，迅速剪下心臟，NS洗凈殘血。將靠近心尖部分的心肌組織置10%福爾馬林中固定，心肌組織切片常規(guī)脫蠟水化，按TUNEL試劑盒說明書操作。正常心肌細胞核呈藍色，凋亡陽性心肌細胞核呈棕黃色。每張切片計數(shù)5個高倍鏡視野(400×)中的凋亡陽性細胞核數(shù)和總細胞核數(shù)，各取其平均值，以凋亡陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)之比計算心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.5.4 HE染色觀察心肌形態(tài) 上述石蠟切片行HE染色，定性觀察心肌形態(tài)學改變。

1.5.5 凝血功能 各組于缺血前和再灌注120 min末由股靜脈取血1 ml，置于含有3.8%檸檬酸鈉的試管中(抗凝劑與全血的體積比為1∶9)，立即混勻。以400×g的速度離心10 min，收集血漿，按FIB、PT、APTT檢測試劑盒說明書分別進行測定。

2 結(jié)果

2.1 血壓與心率 缺血后，各組的平均動脈壓和心率均呈降低趨勢，再灌注后有所回升，但均低于缺血前水平，各組間各時點差異無顯著性。

2.2 心肌梗死面積 各組AAR差異無顯著性。與I/R組相比，I/R+5-HD組IS和IS/AAR比值差異無顯著性，說明5-HD自身對心肌梗死面積無影響;LIP組IS明顯縮小約40%(P＜0.01);IS/AAR比值明顯降低約38.24%(P＜0.05)。而5-HD取消LIP縮小心肌梗死面積的作用。見Fig 1。

Fig 1 Effects of various interventions on myocardial infarctsize during I/R in rats(n=8)

2.3 心肌細胞凋亡 I/R組和I/R+5-HD組AI差異無顯著性，說明5-HD自身對細胞凋亡無影響。與I/R組比較，LIP組 AI降低約 23.33%(P＜0.01)，此作用被5-HD取消。見Fig 2。

2.4 心肌形態(tài) I/R組、I/R+5-HD組、LIP+5-HD組心肌纖維橫紋消失，肌束斷裂，心肌細胞混濁變性，大部分心肌細胞膜不完整，胞質(zhì)嗜酸性變，細胞核溶解消失，大量紅細胞滲出及炎細胞浸潤。LIP組心肌纖維橫紋、心肌細胞核膜較清晰，偶見肌束斷裂，大部分心肌細胞膜完整，少量紅細胞滲出及炎細胞浸潤。見Fig 3。

Fig 2 Effects of various interventions on cardiocyte apoptosis during I/R in rats(n=6)

Fig 3 Effects of various interventions on myocardial morphousduring I/R in rats(HE staining，×400)

2.5 凝血功能

2.5.1 FIB LIP對血漿FIB無影響。I/R后，F(xiàn)IB均明顯增加(P＜0.01)。I/R組和I/R+5-HD組之間差異無顯著性，說明5-HD自身對FIB無影響。LIP組FIB明顯低于I/R組約12.5%(P＜0.05)。5-HD取消LIP降低FIB升高程度的作用。見Fig 4。2.5.2 PT 30 min缺血前各組大鼠PT差異無顯著性。I/R后，各組PT均延長，但各組間差異無顯著性。見Fig 5。

2.5.3 APTT 與30 min缺血前比較，各組 APTT無變化。見Fig 6。

3 討論

本研究結(jié)果表明，LIP可縮小心肌梗死面積，減少心肌細胞凋亡，改善心肌形態(tài)學損傷，降低FIB在I/R后的增加幅度，上述保護作用被5-HD取消，提示mitoKATP可能參與介導LIP的心臟保護作用。

Fig 4 Effects of various interventions onconcentration of FIB in rats(n=8)

Fig 5 Effects of various interventions on PT in rats(n=8)

Fig 6 Effects of various interventions on APTT in rats(n=8)

LIP心臟保護作用機制尚不明確，可能涉及神經(jīng)、體液調(diào)節(jié)機制或者兩者的共同作用［8－9］。腺苷、阿片類物質(zhì)、ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)、內(nèi)源性大麻素類、熱休克蛋白等均有報道可能參與LIP的心臟保護作用。KATP存在兩種類型，分別位于線粒體和細胞膜上。5-HD曾被認為是mitoKATP的特異性阻斷劑，但近年來的研究提示5-HD還可阻斷膜KATP，并影響內(nèi)源性脂肪酸的 β-氧化過程［10－11］。Schmidt等［12］在豬的 I/R模型中，發(fā)現(xiàn)對肢體進行遠端缺血預適應可以減緩惡性的心律失常，減少心肌梗死面積，對心臟起到保護作用，而mitoKATP抑制劑格列本脲可以消除其保護作用，提示mitoKATP開放是關(guān)鍵作用。但Zhao等［13］發(fā)現(xiàn)，小豬的肢體遠端缺血預適應對I/R的保護作用與細胞膜上的KATP關(guān)系密切，而非mitoKATP。Wu等［14］在大鼠無創(chuàng)延遲肢體缺血預適應中發(fā)現(xiàn)，5-HD可以取消LIP縮小心肌梗死面積、緩解惡性室性心律失常等保護作用。本研究表明LIP可縮小心肌梗死面積，減少心肌細胞凋亡，改善心肌形態(tài)學損傷，LIP的心臟保護作用被5-HD取消，提示KATP的開放可能在LIP心臟保護中具有重要的調(diào)節(jié)作用，但鑒于5-HD作用的復雜性，需在后續(xù)研究中使用特異性阻斷劑判斷起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用的KATP類型。

本課題組前期對LIP對纖溶系統(tǒng)的影響進行研究，發(fā)現(xiàn)LIP能明顯對抗血漿中組織型纖溶酶原激活劑的降低和纖溶酶原激活劑抑制物－1活性的升高，推測LIP能糾正心肌I/R時纖溶活性降低的狀態(tài)，抑制血栓的形成從而保護心?。?5］。本研究對凝血指標進行初步檢測，發(fā)現(xiàn)LIP對基礎狀態(tài)下的凝血功能無影響，但能降低I/R后血漿FIB增加程度。提示LIP可能通過減少FIB，防止或減少血栓形成，改善血流動力學，減輕I/R損傷。此作用被5-HD取消，提示KATP可能參與其中，機制尚需進一步研究。

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