王 鵬，朱爭(zhēng)艷，李成龍，駱 瑩，張海鵬，劉 輝

EphA2是一種受體酪氨酸蛋白激酶，可通過(guò)與其配體EphrinAl結(jié)合，導(dǎo)致自身及下游底物蛋白的酪氨酸磷酸化，引起一系列生物學(xué)效應(yīng)，參與正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)化［1］。研究發(fā)現(xiàn)，EphA2受體在多種腫瘤中高表達(dá)，這些癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與EphA2的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)［2－3］。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinorma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、惡性度高，易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)治療的效果均不甚理想［4］，探討HCC的發(fā)病及惡化機(jī)制，對(duì)降低HCC患者的病死率將具有重要意義。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)正常肝細(xì)胞系及兩種肝癌細(xì)胞系中EphA2蛋白的表達(dá)，探討其與肝細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系，并通過(guò)癌細(xì)胞中HBV DNA的定量檢測(cè)，分析EphA2表達(dá)與HBV感染的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人正常肝細(xì)胞系HL7702及人肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2.2.15(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供)。EphA2(clone C-20)兔抗人多克隆抗體(Santa Cruz公司)，免疫組化二抗試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。HBV DNA定量檢測(cè)試劑盒(北京達(dá)安基因有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將3種細(xì)胞系置于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、青霉素 100 U/L、鏈霉素 100 g/mL)中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 免疫化學(xué)染色

取各組細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，加入3%H2O2室溫孵育，PBS沖洗，羊血清室溫封閉。滴加EphA2一抗工作液(1∶100稀釋)，4℃過(guò)夜，滴加二抗工作液(1∶200稀釋)，室溫孵育30 min，PBS沖洗，滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育30 min，PBS沖洗后，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照以 PBS液代替一抗。每張切片隨機(jī)選擇200倍視野，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)(BioMias，四川大學(xué))測(cè)定各組陽(yáng)性細(xì)胞面積。

1.4 Western blot檢測(cè)

提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)蛋白定量后，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，置于5%脫脂奶粉的Tris-HCl溶液(TBS)中封閉2 h，加入EphA2一抗工作液，4℃過(guò)夜。TBS洗膜后，加入二抗工作液，37℃孵育1.5 h，TBS洗膜，加入HRP標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育1 h，TBS洗膜，采用DAB法顯色，結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參條帶(β-actin)吸光度的比值表示。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)

制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL，加入DNA染液，4℃下染色30 min，以500目篩網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，以凋亡率表示凋亡狀態(tài)，利用DNA組方圖各時(shí)相分布的百分比，用增殖指數(shù)(proliferation index，PI)表示細(xì)胞的增殖活性，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 HBV DNA含量測(cè)定

采用熒光定量PCR法檢測(cè)兩種肝癌細(xì)胞中HBV DNA的含量，按照試劑盒說(shuō)明書操作。目標(biāo)基因mRNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出mRNA的分子拷貝數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EphA2在各組細(xì)胞中的表達(dá)

EphA2蛋白陽(yáng)性表達(dá)于胞質(zhì)與胞膜中，呈棕黃色顆粒，與正常肝細(xì)胞中EphA2的染色面積比較，兩種肝癌細(xì)胞中EphA2的平均吸光度值(累積吸光度值/染色面積，IA/area)顯著增大(p＜0.05)，且HepG2.2.15細(xì)胞中EphA2的平均吸光度值顯著高于HepG2中EphA2的平均吸光度值(p＜0.01)(圖1)。Western blot結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞中EphA2蛋白的表達(dá)量比較，兩種肝癌細(xì)胞中E-phA2蛋白的表達(dá)量均顯著升高(p＜0.01)，且HepG2.2.15細(xì)胞中EphA2蛋白的表達(dá)量顯著高于HepG2細(xì)胞中EphA2蛋白的表達(dá)量(p＜0.01)(圖2)。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中EphA2的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果Fig 1 The EphA2 expression of 3 groups(immunocytochemical staining，×400)

2.2 各組細(xì)胞的增殖指數(shù)與凋亡率

與正常肝細(xì)胞的增殖指數(shù)比較，兩種肝癌細(xì)胞的增殖指數(shù)均顯著升高(p＜0.01)，且HepG2.2.15細(xì)胞的增殖指數(shù)顯著高于HepG2細(xì)胞的增殖指數(shù)(p＜0.01)(表1);與正常肝細(xì)胞的凋亡率比較，兩種肝癌細(xì)胞的凋亡率均顯著降低(p＜0.01)，且HepG2.2.15細(xì)胞的凋亡率顯著低于HepG2細(xì)胞的凋亡率(p＜0.01)(表1，圖3);肝細(xì)胞的增殖指數(shù)與EphA2表達(dá)呈顯著的正相關(guān)(p＜0.01)，肝細(xì)胞的凋亡率與EphA2表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)(p＜0.01)(圖4)。

2.3 肝癌細(xì)胞中HBV DNA的含量

圖2 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中EphA2的Western blot結(jié)果Fig 2 The EphA2 protein expression of three groups

HepG2細(xì)胞中 HBV為陰性表達(dá)(－)，HBV DNA的含量均為0拷貝/mL;而HepG2.2.15細(xì)胞中HBV為陽(yáng)性表達(dá)(+)，HBV DNA的含量均大于1×106拷貝/mL;肝癌細(xì)胞中 HBV DNA水平與EphA2的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.878，p＜0.05)(表2)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖指數(shù)與凋亡率Table 1 Proliferation index and apoptotic ration of three groups，%)

表1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖指數(shù)與凋亡率Table 1 Proliferation index and apoptotic ration of three groups，%)

*p＜0.01 compared with HL7702;#p＜0.01 compared with HepG2．

group proliferation index apoptotic ratio HL7702 cell line 30.11±0.18 0.311±0.042 HepG2 cell line 32.01±0.16* 0.169±0.013*HepG2.2.15 cell line 34.83±0.28*# 0.103±0.005*#

表2 肝癌細(xì)胞中HBV DNA水平與EphA2的表達(dá)相關(guān)性分析Table 2 The correlation between the expression of EphA2 protein and HBV DNA level

3 討論

EphA2是一種受體酪氨酸蛋白激酶，在生理?xiàng)l件下以低水平廣泛表達(dá)于各種上皮細(xì)胞中，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)化等。研究發(fā)現(xiàn)，EphA2受體在多種腫瘤中高表達(dá)，這些癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與EphA2的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)［2－3］。EphA2 有望成為一個(gè)理想的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)多種腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷具有重要的臨床意義，但關(guān)于EphA2在腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展中的分子調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其患病人數(shù)正在逐年遞增。中國(guó)是HCC的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率占全球肝癌患者的55%［5］。HCC發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、惡性程度高，易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)治療的效果均不甚理想，探討HCC的發(fā)病及惡化機(jī)制將具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，EphA2在肝癌組織中過(guò)表達(dá)，可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6－7］。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了正常肝細(xì)胞系及兩種肝癌細(xì)胞系中E-phA2蛋白的表達(dá)情況，并探討其與肝細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞比較，兩種肝癌細(xì)胞中 EphA2蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，且EphA2蛋白的異常高表達(dá)，可促進(jìn)肝細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)，抑制肝細(xì)胞的生理凋亡，提示EphA2蛋白的過(guò)表達(dá)在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒(HBV)感染是引起HBV相關(guān)性HCC發(fā)病的重要誘因［8］。因此，EphA2蛋白在HCC中的過(guò)表達(dá)可能與HBV感染具有一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩種肝癌細(xì)胞系中HBV DNA的定量檢測(cè)，分析EphA2表達(dá)與HBV感染的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA水平顯著高于HepG2細(xì)胞中HBV DNA水平，且HepG2.2.15細(xì)胞中EphA2蛋白的表達(dá)水平顯著高于HepG2細(xì)胞中EphA2蛋白的表達(dá)水平，HBV DNA水平與E-phA2表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，提示在肝癌細(xì)胞中E-phA2蛋白的異常高表達(dá)與HBV感染密切相關(guān)。

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