王 瑞，龐希寧*，施 萍

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose mesenchymal stem cells，hADSCs)在體外易于分離、擴(kuò)增，在適當(dāng)?shù)臈l件下具有多向分化潛能，并且可以進(jìn)行自體移植，廣泛遷移，易與周圍組織整合而發(fā)揮功能［1］，提示其在細(xì)胞治療中可能成為非常有價(jià)值的運(yùn)載細(xì)胞。隨著hADSCs在基因治療中的應(yīng)用被人們廣為認(rèn)識和研究，如何針對其建立安全、有效又具有優(yōu)良特性的RNA運(yùn)載系統(tǒng)已成為現(xiàn)今研究的重點(diǎn)。

目前，基因?qū)胼d體主要分為病毒型和非病毒型。病毒型基因載體雖轉(zhuǎn)染效率較高，但具有誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)、潛在成瘤性、裝載容量有限和代價(jià)高等缺點(diǎn)［2］。因此，非病毒基因載體包括磁納米顆粒和脂質(zhì)體的應(yīng)用日益受到重視。脂質(zhì)體是目前應(yīng)用較多的非病毒載體;磁性納米顆粒因具有非侵襲性、低毒性和對細(xì)胞膜強(qiáng)大的穿透性等特點(diǎn)，被認(rèn)為是很有前景的非病毒基因?qū)胼d體［3］。

本研究對磁納米顆粒和脂質(zhì)體作為基因載體分別轉(zhuǎn)染hADSCs進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人皮下脂肪組織樣本由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科提供，并與患者簽署知情同意書。聚乙烯亞胺包被的磁性納米顆粒(東納生物科技有限公司)、DMEM/F12和胎牛血清(Hyclone公司)、100 IU/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素、0.25%胰蛋白酶和MTT試劑盒(Sigma公司)、REST-siRNA(上海吉瑪公司)、lipofectamineTM2000(Invitrogen公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time試劑盒和 real-time引物(Takara公司)、REST一抗(Millipore公司)及二抗(北京鼎國公司)、ECL發(fā)光試劑盒 (GE Healthcare公司)。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs分離、培養(yǎng)及鑒定:將脂肪組織剪碎，去除血管和筋膜，加入2倍體積膠原蛋白酶Ⅰ在37℃消化1 h，每隔15 min輕柔振蕩1次。DMEM/F12培養(yǎng)液加10%胎牛血清進(jìn)行中止并且離心洗滌2～3次，后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶用DMEM/F12培養(yǎng)液加10%胎牛血清 在5%CO2、37℃飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞80% ～90%匯合后予以傳代。取第3代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測 CD105、CD44和CD45抗原。

1.2.2 磁性納米顆粒介導(dǎo)REST-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs:取原代分離培養(yǎng)第3代以后的hADSCs接種6孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞80% ～90%匯合后換液，將PEI-SPIO與REST-siRNA以8∶1混合，室溫靜置30 min后，將混合物加入到6孔板中，搖動混勻，設(shè)置未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照組。

1.2.3 lipofectamineTM2000介導(dǎo)REST-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs:REST-siRNA與lipofectamineTM2000混合比例為0.8μg∶2μL。取 0.8μg REST-siRNA加入無血清培養(yǎng)基稀釋至50μL，另取lipofectamineTM2000 2μL加入無血清培養(yǎng)基稀釋至50μL，室溫靜置5 min，二組液體輕輕混勻后，室溫靜置20 min，然后加至待轉(zhuǎn)染hADSCs無血清培養(yǎng)基中，6 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)置未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照組。

1.2.4 磁性納米顆粒和 lipofectamineTM2000分別介導(dǎo)GFP進(jìn)入細(xì)胞情況檢測:分別于標(biāo)記24 h后，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染進(jìn)GFP的hADSCs的情況。隨機(jī)計(jì)數(shù)顯微鏡10個(gè)視野下發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染效率 =發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 MTT比色法檢測細(xì)胞活性:分別將轉(zhuǎn)染48 h后的hADSCs種入96孔板中，檢測各孔的細(xì)胞成活率及增殖活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測磁性納米顆粒和脂質(zhì)體的瞬時(shí)干擾效率:分別收集未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染REST-siRNA的hADSCs細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA。檢測濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以 GAPDH為內(nèi)參，ΔΔCt法計(jì)算REST mRNA的相對水平。SYBR Premix Ex TaqTMTaKaRa試劑盒用來實(shí)時(shí)定量PCR檢測目的基因在各組細(xì)胞中的表達(dá)。所用引物如下:REST上游引物:5'-ATTGAAGTTGGCTTAGTG-3';下游引物:5'-TATGGGTAGATTCGTTGA-3';以GAPDH為內(nèi)參，上游引物:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物:5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3';反應(yīng)體系:2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物(10μmol/L)各 0.8μL，ROX DyeⅡ 0.4 μL，cDNA 2μL，雙蒸水6μL。反應(yīng)條件為 95℃ 30 s，95℃5 s，60℃延伸34 s，循環(huán)40次，做熔解曲線。每個(gè)反應(yīng)有3次重復(fù)。

1.2.7 Western blot法檢測磁納米顆粒法和脂質(zhì)體法瞬時(shí)干擾效率:按常規(guī)方法收集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入適量RIPA緩沖液，4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清。樣品經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉過夜，在10 mL含5%脫脂奶粉的TBST中加入4μL REST抗體，4℃搖床(100 r/min)孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在分離后3 d貼壁生長，成長梭形，可見細(xì)胞系，分散排列，懸浮的球形細(xì)胞經(jīng)換液后逐漸減少。培養(yǎng)11 d后，倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞克隆，出現(xiàn)致密的貼壁層(圖1)。取第3代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定，結(jié)果細(xì)胞CD105、CD44和CD45表面抗原表達(dá)陽性率分別為99.4%、99.7%和2.7%(圖2)。

2.2 熒光顯微鏡觀察磁性納米顆粒和脂質(zhì)體作為基因載體時(shí)的轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染進(jìn)GFP的hADSCs發(fā)出綠色熒光，磁納米顆粒和脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率無差異，分別為75%和71%(圖3)。

2.3 磁納米顆粒和脂質(zhì)體作為基因載體轉(zhuǎn)染hADSCs后對其活性的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，未轉(zhuǎn)染組hADSCs的A570為0.80±0.03，磁性納米顆粒組轉(zhuǎn)染hADSCs的A570為0.75±0.06，脂質(zhì)體組轉(zhuǎn)染 A570為0.64±0.04(p＜0.05)(圖4)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察不同時(shí)期培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)Fig 1 Inverted microscope was used to observe the culture of human adipose mesenchymal stem cells cell morphology in different periods(×40)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定hADSCsFig 2 Flow cytometry analysis were performed on the hADSCs

圖3 熒光顯微鏡觀察磁納米顆粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率Fig 3 Fluorescence microscope was used to observe the transfection efficiency of magnetic nanoparticles and lipofectamineTM 2000(×40)

4 MTT法檢測磁性納米顆粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染hADSCs對其增殖的影響Fig 4 Cell proliferation activity was detected with MTT method after magnetic nanoparticles andlipofectamineTM 2000 transfect hADSCs

2.4 Western blot檢測磁性納米顆粒作為基因載體時(shí)REST的表達(dá)

磁納米顆粒作為基因載體介導(dǎo)REST-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs后REST的蛋白表達(dá)量為0.501±0.006，顯著低于對照組的0.924±0.003(p＜0.05)(n=3)(圖5)。

2.5 Real-time PCR檢測磁納米顆粒作為基因載體時(shí)REST的表達(dá)

磁納米顆粒作為基因載體介導(dǎo)REST-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs后REST的RNA表達(dá)量為0.46±0.04，顯著低于對照組的1.00±0.08(p＜0.05)。

2.6 Western blot檢測脂質(zhì)體作為基因載體時(shí)REST的表達(dá)

脂質(zhì)體作為基因載體介導(dǎo)REST-siRNA轉(zhuǎn)染hADSC后 REST的蛋白表達(dá)量為0.523±0.004，顯著低于對照組的1.000±0.007(p＜0.05)(n=3)(圖6)。

圖5 Western blot檢測磁納米顆粒作為基因載體時(shí)REST的表達(dá)Fig 5 Western blot result of REST expression after magnetic nanoparticles transfect hADSCs

圖6 Western blot檢測脂質(zhì)體作為基因載體時(shí)REST的表達(dá)Fig 6 Western blot result of REST expression after lipofectamineTM 2000 transfect hADSCs

2.7 Real-time PCR檢測脂質(zhì)體作為基因載體時(shí)REST的表達(dá)

脂質(zhì)體作為基因載體介導(dǎo)REST-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs后REST的RNA表達(dá)量為0.53±0.05，顯著低于對照組的1.00±0.04(p＜0.05)。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)不但可以作為種子細(xì)胞移植進(jìn)目標(biāo)組織內(nèi)，分化替代為相對應(yīng)的組織功能細(xì)胞，還可以作為基因治療的載體細(xì)胞［4－6］。hADSCs與骨髓來源的 MSC具有相似的多向分化能力，且具有容易獲取、體內(nèi)分布廣、取材創(chuàng)傷小、可多次抽取、采集效率高以及細(xì)胞獲得量大等優(yōu)點(diǎn)。因此，hADSCs作為種子細(xì)胞在組織工程中具有很好的應(yīng)用前景。

基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法有病毒載體介導(dǎo)和非病毒載體介導(dǎo)兩種。病毒載體雖然轉(zhuǎn)染率高，如慢病毒載體轉(zhuǎn)染 MSCs可有高達(dá)95%的轉(zhuǎn)染率［7－8］;反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的MSCs轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%～90%［9－10］，但面臨安全性、免疫排斥等問題［10－11］。磁納米顆粒是目前新興的非病毒基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，它是一種MRI對比劑，其特點(diǎn)是粒徑小，穿透力強(qiáng)，且具有生物可降解性［12－15］。用磁納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞，采用核磁共振成像(MRI)進(jìn)行活體示蹤的研究技術(shù)在不斷完善。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法是目前應(yīng)用最多的非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，但有顯著缺點(diǎn)，例如對細(xì)胞有明顯毒性。故本實(shí)驗(yàn)對磁納米顆粒和脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染基因至hADSCs進(jìn)行了比較，研究新型脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和磁納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植領(lǐng)域的前景及探討作為基因轉(zhuǎn)染載體的可行性。結(jié)果表明:磁納米顆粒細(xì)胞毒性低于脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染效率和瞬時(shí)干擾效率與脂質(zhì)體相當(dāng)，故可代替脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染干細(xì)胞的基因載體。

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