馬有智

(浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310030)

嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophica，Ah)是有鞭毛無莢膜的革蘭氏陰性短桿菌，可引起蛙類的紅腿病等［1］。由于抗生素的濫用，導致嗜水氣單胞菌的耐藥性增強，多重耐藥性菌株不斷增加［2-4］，給水產(chǎn)動物嗜水氣單胞菌病的防治造成困難，同時嚴重影響水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。生物被膜(Biofilm，BF)是指附著在任何物體表面或兩相交界面的具有一定結(jié)構(gòu)的微生物群體，其外包裹了一層由其自身分泌的胞外多糖類基質(zhì)［5］。與游離菌相比，形成生物被膜的細菌具有很多不同的性能，其特征是對抗菌劑的抗性增強。試驗對分離自發(fā)病的棘胸蛙細菌生物被膜進行測定和形態(tài)觀察，為監(jiān)控嗜水氣單胞菌的耐藥性和有效防治嗜水氣單胞菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌AH02，AH03，AH06和AH07，分離自發(fā)病的棘胸蛙。小白鼠，體重15～20 g，購自浙江大學實驗動物中心，試驗前飼養(yǎng)3 d，證實健康后應用。健康棘胸蛙來自杭州某棘胸蛙養(yǎng)殖場，規(guī)格為25～35 g，室內(nèi)暫養(yǎng)7 d無異常后應用。

1.2 生物被膜檢測

體外生物被膜形成及測定方法參照文獻 ［6］的微孔板法并進行適當改進。具體步驟:將細菌過夜培養(yǎng)液與新鮮BHI培養(yǎng)液按1∶3體積混勻后，取200μL加入到96孔酶標板小孔中，28℃濕盒靜置培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，用0.85%的無菌生理鹽水250μL洗滌2次以去除游離細菌，干燥后往各孔加入200μL 0.1%結(jié)晶紫染色液，染色30 min后棄去染色液，0.85%的無菌生理鹽水250μL洗滌3次，加入33%的乙酸溶液200μL，30 min后完全溶解，用酶標儀測其D570值。各試驗孔均設(shè)8個平行孔，以不含菌液的培養(yǎng)液為空白對照。

1.3 生物被膜掃描電鏡觀察

將細菌過夜培養(yǎng)液按1∶20稀釋，轉(zhuǎn)接到24孔細胞培養(yǎng)板上，各孔中垂直放置大小合適的無菌蓋玻片，28℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出蓋玻片，按照電鏡掃描的要求進行制片觀察。

1.4 動物試驗

小白鼠毒力試驗。取分離株18 h BHI培養(yǎng)物，分別腹腔注射6只小白鼠。每只小鼠注射劑量為0.2 mL，觀察發(fā)病和致死情況。

動物回歸試驗。分離株接種于BHI液體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)18 h后，細菌濃度調(diào)整為2.27×107mL-1備用。健康棘胸蛙隨機分成2組，實驗組取10只，按每只0.2 mL劑量腹腔注射菌懸液;對照組10只腹腔注射相同劑量無菌肉湯。連續(xù)觀察記錄7 d，對發(fā)病棘胸蛙無菌操作取其肝、脾等進行病原菌的分離純化。1.5 藥物敏感性試驗

藥物敏感性采用紙片 (藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司)瓊脂擴散法進行。調(diào)節(jié)菌懸液細菌濃度為1.7×107mL-1，操作方法及結(jié)果判定參照文獻 ［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生物被膜D值

圖1表明，4株細菌在BHI培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24 h后，形成生物被膜的能力不同，AH07最高，AH02和AH03次之，AH06最低。差異分析顯示，AH07，AH03與AH06之間有極顯著差異 (p＜0.01)，AH02與AH06之間有顯著差異 (p＜0.05)。

圖1 嗜水氣單胞菌分離菌株培養(yǎng)24 h的生物被膜測定結(jié)果

2.2 菌株生物被膜電鏡掃描

從電鏡掃描結(jié)果 (圖2)看，4株菌形成的生物被膜的緊密程度不同，AH07細菌之間緊密度最高;AH06緊密度最低，細菌之間不能緊密相連，形成較大的裂隙;AH02和AH03細菌間緊密度較AH07要低一些。

圖2 嗜水氣單胞菌分離菌株形成的生物被膜的電鏡掃描結(jié)果 (×10 000)

2.3 菌株對小白鼠的致病性

4株細菌對小白鼠均表現(xiàn)出一定的致病性，其中接種AH02，AH03和AH07等3株細菌的小白鼠均在24 h內(nèi)死亡，AH06菌株引起3只小白鼠死亡，死亡率為50%，對照組無異常，顯示4株嗜水氣單胞菌分離菌株都具有一定的致病力，AH06菌株致病力較弱。

試驗組棘胸蛙腹腔注射菌懸液后，在7 d內(nèi)注射AH02和AH07菌株的全部死亡，注射AH03的死亡9只，注射AH06組死亡6只，發(fā)病棘胸蛙表現(xiàn)出與自然發(fā)病棘胸蛙相似的癥狀，對照組無異常表現(xiàn)。

4株細菌均對氧氟沙星敏感;AH02，AH03和AH06對四環(huán)素、氯霉素、慶大霉素等藥物敏感;AH07對氨芐青霉素、大觀霉素、阿米卡星、四環(huán)素、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素耐藥。

3 小結(jié)與討論

細菌生物被膜是細菌耐藥性形成的重要機制之一，也是許多慢性感染性疾病反復發(fā)作和難以控制的主要原因，生物被膜的形成與細菌的致病性也具有一定的相關(guān)性［8-9］。分離自發(fā)病的棘胸蛙嗜水氣單胞菌菌株之間毒力存在差異，AH02，AH03和AH07等3株細菌對小鼠和棘胸蛙均具有較強的毒力，而AH06菌株的毒力較弱，菌株之間的差異也表現(xiàn)在理化特性上，AH06菌株V-P試驗為陽性，在綿羊血平板上不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，而溶血素與細菌毒力相關(guān)［10］。藥敏試驗表明4株分離菌對抗生素的敏感性不同，其中3株菌對左氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素等均敏感，而AH07菌株對氨芐青霉素等多種抗生素耐藥，且AH07菌株形成生物被膜的能力也最強，說明生物被膜的形成與細菌的耐藥性有一定的關(guān)系，這一結(jié)果為臨床防治中抗生素的選擇提供依據(jù)。4株分離菌的毒力和生物被膜形成能力具有一定的差異，AH02，AH03和AH07等3株細菌對試驗動物的致病性較強，其生物被膜的形成能力也較強，電鏡掃描圖也顯示緊密度要高一些，而AH06菌株的致病性與生物被膜的形成量均較其他3株菌低，說明致病性與生物被膜的形成有一定的關(guān)系，至于兩者之間關(guān)系的機制還需要進一步的研究。

［1］ 陸承平.致病性嗜水氣單胞菌及其所致魚病綜述［J］.水產(chǎn)學報，1992(16):282-288.

［2］ 洪經(jīng)，潘連德.魚源嗜水氣單胞菌質(zhì)粒的指紋圖譜及其與耐藥性的關(guān)系［J］.水產(chǎn)學報，2010，34(12):1908-1915.

［3］ 宋鐵英，陳強，鄭在予，等.不同來源嗜水氣單胞菌的抗菌素耐藥性及耐藥機制分析 ［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2008，23(2):119-124.

［4］ Vlvekanandhan G，Savithamani K，Hatha A A M，et al.Antibiotic resistance of Aeromonas hydrophila isolated form marketed fish and prawn of South India ［J］.International Journal of Food Microbiology，2002，76(1/2):165-168.

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