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        大麻素受體在肝星狀細(xì)胞活化中的作用及姜黃素干預(yù)效應(yīng)

        2013-12-07 05:37:42張自力王妤清倪雯霞孔德松鄭仕中
        中國藥理學(xué)通報 2013年5期
        關(guān)鍵詞:大麻拮抗劑激動劑

        張自力,張 涉,郭 瑤,王妤清,倪雯霞,張 衍,孔德松,鄭仕中,3

        (南京中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院、2.中藥學(xué)一級學(xué)科;3.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,江蘇南京 210023)

        肝纖維化(hepatic Fibrosis,HF)是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷之后組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng),也是慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過程。肝纖維化發(fā)生時肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)異常活化增殖,并合成與分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),最終導(dǎo)致ECM的過度沉積[1-2]。抑制 HSCs增殖、促進(jìn)其凋亡已然成為當(dāng)前抗肝纖維化治療的主要策略[3-4]。

        內(nèi)源性大麻素及其受體—大麻素受體1(cannabinoid receptor type 1,CBR1)和大麻素受體2(cannabinoid receptor type 2,CBR2)共同構(gòu)成了內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)。最近的研究表明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)參與急性與慢性肝病以及如肝性腦病等引起的并發(fā)癥改善與恢復(fù)過程,并被認(rèn)為可能是抗肝纖維化的潛在治療靶點[5-6]。姜黃素(Curcumin)是姜黃屬(Curcuma L.)植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取的一種天然活性成分,用于疾病的治療已經(jīng)有悠久的歷史。隨著研究的深入,姜黃素治療肝纖維化及其作用機制的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點[7]。那么大麻素受體在姜黃素治療肝纖維化的過程中扮演何種角色,目前尚未見諸報端,我們對其進(jìn)行了深入的探討。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑與儀器 SPF級♂ SD大鼠若干只(上海斯萊克公司,SCXK(滬)2011-0005),姜黃素(SIGMA,No.045K0933,含量≧99.8%),DMEM 培養(yǎng)基(Gibco),小牛血清(Gibico),BCA試劑盒(Pierce),MTT(Promega),一抗 MAPK(ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38,p-p38,Cell Signaling),CBR1和 CBR2(Bioword),α1(I)collagen和 Fibronectin(Epitomics),β-actin(Sigma);FITC 綠色熒光二抗(武漢博士德)。恒溫水浴槽(成都儀器廠,型號HSS-1B),恒流泵(上海青浦滬西儀器廠,型號HL-2),全自動高壓滅菌鍋(SANYO,型號 MLS-3020),萊卡倒置熒光顯微鏡 (德國萊卡公司,型號DM1L),超低溫冰箱(美國紐艾爾公司,型號Nu-6511),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(FORMA,型號3111),純水儀(Spring,型號 S/N020579),核酸蛋白分析儀(BECKMAN,型號DU640),電泳槽(Bio-Rad,型號525BR027843)。

        1.2 原代大鼠HSCs的分離與培養(yǎng) 按照改良的原代酶消化循環(huán)灌流法[8],Nycodenze密度梯度離心分離提取大鼠原代HSCs,將分離的HSCs進(jìn)行通過使用DMEM重懸的方法進(jìn)行簡單的分離、純化,然后采用含20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)所得的原代細(xì)胞,傳代4~8代用于實驗。細(xì)胞分為實驗組與空白對照組,實驗組加入相應(yīng)的藥物與刺激物,空白對照則加入DMEM做為陰性對照。實驗過程中對動物的處置經(jīng)過南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的審批且符合科技部有關(guān)善待實驗動物的規(guī)定。

        1.3 MTT檢測 傳代的HSCs調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后接種于96孔板,每孔 180 μl,1×104個/孔。置37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后除對照組外各組分別加入相應(yīng)濃度的CBR1與CBR2激動劑與拮抗劑進(jìn)行干預(yù)處理24 h,每組6個復(fù)孔。作用時間結(jié)束后加入5μg·L-1MTT 溶液 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除上清,每孔加入200 μl DMSO,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的OD值。評價藥物對細(xì)胞的增殖抑制作用。

        1.4 Western blot檢測 HSCs經(jīng)藥物干預(yù)處理后,用冰冷的RIPA裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解,收集細(xì)胞裂解物,-80℃儲藏過夜。蛋白混合液融化,于4 ℃、12 000 r·min-1下離心15 min,吸取上清 BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg,進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,NC轉(zhuǎn)膜,非特異性封閉;加入相應(yīng)一抗,4℃過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行雜交。加入ECL發(fā)光劑1 ml,曝光、顯影、定影,灰度掃描以定量。

        1.5 細(xì)胞免疫熒光分析 將HSCs接種多聚賴氨酸包被載玻片,培養(yǎng)細(xì)胞至60% ~80%融合率,藥物干預(yù)處理24 h后,固定、洗滌、封閉,以兔抗CBR1抗體(1∶200,Bioword),4℃孵育過夜,空白對照以磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)孵育過夜。PBS洗3遍,以羊抗兔(1∶60,武漢博士德)FITC標(biāo)記的熒光二抗孵育1 h,PBS洗3遍后,進(jìn)行Hochest染色以標(biāo)記細(xì)胞核。熒光封片劑封片,熒光顯微鏡觀察、拍照。

        2 結(jié)果

        2.1 CBR1、CBR2受體激動劑與拮抗劑對 HSCs增殖活性的影響 應(yīng)用MTT實驗探討CBR1激動劑(NADA)與拮抗劑(AM251),CBR2激動劑(JWH015)與拮抗劑(AM630)的對HSCs增殖的作用效果。結(jié)果表明激動CBR1可促進(jìn)HSCs的增殖,相反拮抗CBR1后則可以抑制HSCs的增殖(P<0.05)。同時激動CBR2也可抑制HSCs的增殖(P<0.05),但抑制CBR2時對HSCs的增殖就沒有明顯的影響(P>0.05)(Fig 1)。由此可見大麻素受體在HSCs的增殖活化中具有重要作用。

        2.2 CBR1受體拮抗劑對HSCs中MAPK信號通路的影響 CBR1與CBR2在HSCs中都有表達(dá),但CBR1在HSCs活化與增殖中起主要調(diào)控作用,而CBR2主要分布在免疫細(xì)胞中[9]。因此,我們應(yīng)用CBR1拮抗劑AM251作用于HSCs,觀察其對HSCs中MAPK信號通路的影響。結(jié)果表明,CBR1拮抗劑能夠明顯抑制ERK與JNK的磷酸化,并呈劑量依賴性的關(guān)系(P<0.05),但對P38蛋白的表達(dá)沒有什么影響(P>0.05)。

        2.3 姜黃素對CBR1與CBR2蛋白表達(dá)的影響我們的前期研究證實姜黃素在體內(nèi)外對肝纖維化具有明顯的治療效果,可上調(diào)HSCs中的PPARγ,抑制TGF-β信號通路[10]。本次實驗我們又通過Western bolt與細(xì)胞免疫熒光檢測了姜黃素對HSCs中兩種類型大麻素受體CBR1與CBR2蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明姜黃素可抑制HSCs中CBR1的表達(dá)(P<0.05),但對CBR2的蛋白表達(dá)沒有明顯的影響(P>0.05)。

        2.4 姜黃素對CBR1激動劑與拮抗劑的刺激下HSCs表達(dá)ECM成分α1(I)collagen和Fibronectin的影響 為進(jìn)一步研究大麻素受體信號通路在姜黃素抑制HSCs活化增殖中的作用。我們分別加入CBR1的激動劑NADA與拮抗劑AM251,觀察姜黃素對HSCs表達(dá)ECM成分α1(I)collagen和Fibronectin的影響。結(jié)果表明姜黃素可呈劑量依賴性的抑制CBR1激動劑導(dǎo)致的ECM成分表達(dá)的上升,并可協(xié)同CBR1拮抗劑抑制HSCs表達(dá)ECM成分的作用(P<0.05,P<0.01)。

        Fig 1 Cell proliferation detection

        Fig 2Inhibitory effects of CBR1 antagonist AM251 on MAPK pathway in HSCs(±s)

        Fig 3Influence of curcumin on CBR1 and CBR2 protein expression(±s)

        Fig 4 Effect of curcumin on protein expression of CBR1 by the fluorescence microscope

        3 討論

        我國是肝病大國,肝纖維化已經(jīng)成為影響人們身體健康的重大疾病。多年來學(xué)者們一直致力于尋找安全、有效的抗肝纖維化的藥物。已有研究證實姜黃素具有確切的預(yù)防和治療纖維化的作用,可明顯減輕多種損傷因子導(dǎo)致的肝臟損傷,并能明顯改善四氯化碳(CCl4)所致大鼠纖維化的病理學(xué)改變[7,11]。進(jìn)一步加強姜黃素對參與HSCs活化信號通路調(diào)控及ECM沉積干預(yù)機制的研究,對于闡明肝纖維化發(fā)病機制及開發(fā)新型、有效抗肝纖維化藥物至關(guān)重要。

        以往對內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng),但近年來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻素及其相應(yīng)的受體在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中也起一定作用。動物實驗研究發(fā)現(xiàn),CCl4或酒精誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型中,給予CBR2受體拮抗劑可以使肝纖維化的發(fā)生發(fā)展速度加快,纖維化程度明顯加重,而激活CBR2受體可以有效抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[12]。對CBR1受體研究發(fā)現(xiàn),激活CBR1受體可以促進(jìn)肝纖維化發(fā)展,給予CBR1受體拮抗劑(例如:SR141716A)可以減輕肝臟急性損傷時肝組織損傷修復(fù)反應(yīng),抑制肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程,給予CBR1基因敲除小鼠CCl4或酒精誘導(dǎo)肝纖維化,CBR1基因敲除小鼠肝臟纖維化發(fā)生發(fā)展較正常組小鼠的速度明顯減慢,其纖維化程度也較正常組的減輕[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)體外激動或者拮抗HSCs大麻素受體,則同樣能夠獲得與體內(nèi)實驗相同的結(jié)果。這表明大麻素受體信號通路在肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展過程的確實具有重要的作用。

        Fig 5 Curcumin inhibited the expression of ECM components in HSCs stimulated by CBR1 agonist NADA(±s)

        在肝纖維化發(fā)生時大麻素受體可能參與HSCs中的MAPK信號通路的調(diào)控[13-14]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn) CBR1的拮抗劑 AM251可抑制 HSCs中ERK、JNK的磷酸化水平。應(yīng)用姜黃素干預(yù)HSCs時,會導(dǎo)致CBR1表達(dá)降低。進(jìn)一步應(yīng)用大麻素受體激動劑與拮抗劑分別進(jìn)行干預(yù)處理并觀察姜黃素對HSCs表達(dá)ECM成分的影響,姜黃素不僅能劑量依賴性的抑制CBR1激動劑導(dǎo)致的ECM成分表達(dá)的上升,并可協(xié)同 CBR1拮抗劑抑制HSCs表達(dá)ECM成分的作用。結(jié)果表明姜黃素抑制肝星狀細(xì)胞活化與增殖的作用部分依賴于對大麻素受體信號通路的干預(yù)作用。我們的研究證實了大麻素受體在姜黃素抑制HSCs增殖、活化中的重要作用。本研究為肝纖維化的研究及治療提供了新的思路,豐富了中藥在治療肝纖維化方面的機制研究,對推進(jìn)中藥治療肝纖維化的研究具有重要意義。但本研究同樣還有很多未解決的問題,比如:姜黃素是通過何種途徑影響大麻素受體表達(dá)的?大麻素受體又是怎樣影響ECM合成的等等,還需要進(jìn)一步的深入研究。

        Fig 6 HSCs were treated with DMEM,or,curcumin and/or AM251 at the indicated concentrations for 24 h(±s)

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