李健猴，凌芳芳，杜金燕，何蓉蓉，栗原博，陳衛(wèi)民，陳建新

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642;2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510632)

2009年初，墨西哥和美國相繼爆發(fā)的甲型H1N1流感迅速蔓延至多個國家和地區(qū)，給人類健康造成了極大危害［1］。截止2010-08-06，全球已有214個國家報告甲型H1N1流感病例，共計近兩萬人死亡［2］。目前，該毒株已成為人際間傳播的主要流行性毒株之一。國際上已批準用于治療流感病毒感染的藥物主要有M2離子通道抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)和神經(jīng)氨酸酶抑制劑(奧司米韋、扎那米韋和帕拉米韋)。但由于這些化學(xué)治療藥物廣泛而頻繁使用，以致耐藥毒株大量出現(xiàn)，極大限制了這些藥物的抗流感作用效果。尋找新的抗流感藥物及新的療法成為當前國際醫(yī)藥界的重要研究課題。聯(lián)合用藥具有增強藥效，降低耐藥性，減少用藥量及藥物副作用等優(yōu)點［3］，因而成為目前國際抗流感研究的熱點。

黃芩苷(Baicalin)是黃芩的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗微生物及保護心血管等多種藥理作用而廣泛用于臨床［4－7］。帕拉米韋 (Peramivir)為新型神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)抑制劑，2010年日本已批準帕拉米韋注射液用于臨床治療流感;最近，為應(yīng)對我國新出現(xiàn)的H7N9亞型流感病毒導(dǎo)致的人類感染，帕拉米韋氯化鈉注射液被批準上市［8］。但已有研究報道發(fā)現(xiàn)，流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因中E119D、H275Y等突變可導(dǎo)致其對帕拉米韋耐藥［9，10］?？梢酝茰y，隨著帕拉米韋臨床上的廣泛長期應(yīng)用，其誘導(dǎo)的耐藥毒株也會日趨增多。為減緩耐藥毒株的產(chǎn)生，減少帕拉米韋的用量，本文首次采用黃芩苷與帕拉米韋聯(lián)用，考察其體內(nèi)外對甲型H1N1流感病毒的藥效，旨在為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑 黃芩苷(四川維克奇公司，純度≥98%)，溶于二甲基亞砜(DMSO)，保存于4℃，用前以細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM)稀釋，供細胞試驗用;溶于含質(zhì)量分數(shù)為5%NaHCO3的生理鹽水中，供小鼠試驗用。帕拉米韋由本實驗室合成，純度≥96%，DMEM或生理鹽水直接溶解，分別用于細胞及小鼠試驗。DMEM培養(yǎng)液(HyClone公司);胎牛血清(杭州四季青公司);青霉素/鏈霉素溶液、胰蛋白酶(Gibco公司);四甲基噻唑藍(MTT)、DMSO(Sigma公司)。

1.2 實驗動物 6周齡SPF雌性BALB/c小鼠，體重15～17 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物合格證號:SCXK(粵)2008-0002。

1.3 細胞株與病毒 狗腎細胞傳代細胞株(MDCK)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞資源中心;A/Guangzhou/03/2009(H1N1)流感病毒株由廣東省疾病預(yù)防控制中心惠贈，該病毒經(jīng)本研究室SPF雞胚傳代擴增并保存。

1.4 主要儀器 ELX-UV800酶標檢測儀(Biotex公司，美國);HERA cell 150二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國);D-63505生物光學(xué)倒置顯微鏡(Leica公司，德國)。

1.5 藥物毒性試驗

1.5.1 細胞毒性試驗 用MTT法測定黃芩苷對MDCK 細胞的毒性［11］。按 Reed ＆ Muench 方法［12］確定半數(shù)毒性濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。

1.5.2 小鼠毒性試驗 將BALB/c鼠隨機分為正常對照組和不同濃度試驗藥物組，每組10只，灌胃給藥，對照組灌服等體積生理鹽水，連續(xù)給藥5天，試驗前和最后一次給藥12 h后稱體重，觀察小鼠體征，并記錄小鼠死亡情況，直至第21天試驗結(jié)束。

1.6 藥物聯(lián)用細胞試驗 將DMEM(含1 μg·L－1TPCK處理過的胰蛋白酶)稀釋的100 TCID50病毒液加入長有單層MDCK細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔 100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 2 h 后，棄掉病毒液，PBS液洗兩次，之后加入倍比稀釋的黃芩苷和帕拉米韋，詳見Tab 1。每聯(lián)合濃度重復(fù)兩孔，同時設(shè)置正常對照組，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育72 h后將96孔板密封，放入－80℃冰箱，反復(fù)凍融3次，用終點稀釋法［11］分別測定其上清液病毒滴度。

1.7 藥物聯(lián)用小鼠試驗 將小鼠隨機分為正常對照組、病毒對照組、試驗藥物組，每組10只。小鼠在乙醚輕度麻醉下，滴鼻感染5倍LD50的H1N1病毒稀釋液，每只滴鼻50 μl，正常對照組滴予等量生理鹽水，感染前24 h開始給藥。黃芩苷濃度為250或500 mg·kg－1·d－1，灌服，每天兩次，間隔 12 h，每次0.2 ml;帕拉米韋濃度為 2 或 4 mg·kg－1·d－1，肌肉注射，每天一次，每次0.1 ml。連續(xù)給藥5 d，病毒對照組和空白組給予等量生理鹽水。逐日觀察小鼠發(fā)病情況并記錄其死亡數(shù)，隔天稱量小鼠體重。共觀察21 d，根據(jù)觀察結(jié)果計算每組小鼠存活率，平均存活時間和平均體重變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物聯(lián)用細胞試驗結(jié)果 藥物細胞毒性試驗結(jié)果顯示，黃芩苷對MDCK細胞的TC0為480±21.2 μmol·L－1，帕拉米韋的 TC0＞310 μmol·L－1，而黃芩苷(220 μmol·L－1)與帕拉米韋(0.6 μmol·L－1)聯(lián)合顯示無毒。因此，本試驗以 220 μmol·L－1的黃芩苷和 0.6 μmol·L－1的帕拉米韋為起始濃度進行聯(lián)合給藥，細胞上清液的病毒滴度測定結(jié)果見Tab 1。結(jié)果顯示，單獨給藥治療時，黃芩苷(220 μmol·L－1)和帕拉米韋(0.6 μmol·L－1)，均能完全抑制流感病毒的增殖。

Tab 1 Inhibition of baicalin plus peramivir on multiplication of influenza A/Guangzhou/03/2009(H1N1)virus in MDCK cells

利用MacSynergyⅡ軟件分析Tab 1結(jié)果，得到黃芩苷和帕拉米韋聯(lián)用抗甲型H1N1流感病毒的協(xié)同值之和為 22.9。但當 27.5 ～55 μmol·L－1黃芩苷與0.15 μmol·L－1帕拉米韋聯(lián)用時，則表現(xiàn)出拮抗作用，拮抗值之和為－19.7，所以總的協(xié)同值3.2(Fig 1)，表明黃芩苷體外聯(lián)合帕拉米韋抗流感病毒表現(xiàn)出相加作用。

2.2 藥物聯(lián)用小鼠試驗結(jié)果 本文小鼠毒性試驗結(jié)果顯示，3 000 mg·kg－1·d－1的黃芩苷對 BALB/c鼠無任何的毒性。根據(jù)兩種藥物單獨應(yīng)用的體內(nèi)藥效試驗結(jié)果，我們確定黃芩苷與帕拉米韋聯(lián)用的最大劑量分別為500和4 mg·kg－1·d－1。兩種藥物單用及聯(lián)用對感染甲型H1N1流感病毒小鼠的保護結(jié)果見Tab 2。與單獨用藥相比，聯(lián)合用藥在對提高感染小鼠的死亡保護率、平均存活天數(shù)(MDD)和抑制其體重下降方面有明顯的改善。利用MacSynergyⅡ軟件分析了試驗各組小鼠的保護率和體重變化，結(jié)果聯(lián)合用藥對感染小鼠保護率的協(xié)同值為69.0，表現(xiàn)為中等協(xié)同作用;聯(lián)合用藥對抑制感染小鼠體重下降的協(xié)同值為105.2，表現(xiàn)為強協(xié)同作用。以上結(jié)果表明聯(lián)合用藥體內(nèi)抗甲型H1N1流感病毒作用表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。

Fig 1 Three-dimensional plots showing the reduction of virus yield in MDCK cells by baicalin-peramivir combination against A/Guangzhou/03/2009(H1N1)

Tab 2 Protection of baicalin and peramivir used alone or in combination on mice infected with influenza A/Guangzhou/03/2009(H1N1)virus

3 討論

在流感病毒感染過程中，機體長時間經(jīng)受病毒侵襲和體內(nèi)高病毒量致使藥物選擇壓力增加，繼而導(dǎo)致耐藥毒株的出現(xiàn)。據(jù)報道稱，2009年流行的甲型H1N1流感病毒對金剛烷胺、金剛乙胺等抗病毒藥物已有不同程度的耐藥性［14］，這將大大增加單一藥物治療的難度。本試驗首次選用黃芩的藥效成分黃芩苷與NA抑制劑帕拉米韋聯(lián)合應(yīng)用，獲得了良好的抗流感協(xié)同效應(yīng)。

黃芩是重要的清熱解毒類中藥，在“清開靈”和“雙黃連”等廣泛用于流感防治的中成藥中，黃芩均為主要原料［15］。黃芩苷及其苷元黃芩素(Baicalein)在黃芩中的含量分別高達10.1%和5.4%［16］，是黃芩的主要活性成分。蘇真真等報道，黃芩素是通過干擾流感病毒中后期mRNA的合成而抑制病毒的復(fù)制［17］。而萬巧鳳等人先后發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過影響細胞凋亡受體途徑FAS/FAS-L系統(tǒng)或抑制流感病毒感染引起的轉(zhuǎn)錄因子AP-1高表達而降低炎性細胞因子的分泌水平，發(fā)揮抗流感病毒作用［18，19］。此外，何子華等還報道黃芩苷對流感病毒的NA具有一定的抑制作用［11］。Woo K J等研究證明黃芩苷和黃芩素對LPS誘導(dǎo)的一氧化氮酶 (iNOS)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)和核因子 (NF-κB)等炎癥通路的激活均具有抑制活性［20，21］。由此可見，黃芩苷通過多種途徑發(fā)揮其抗流感病毒作用。

本試驗中黃芩苷與帕拉米韋聯(lián)用對感染甲型H1N1流感病毒小鼠具有顯著的協(xié)同保護作用，療效明顯優(yōu)于藥物單用。在MDCK細胞中，兩者聯(lián)用對病毒增殖的抑制作用僅表現(xiàn)為相加效應(yīng)，沒有協(xié)同作用。其原因是黃芩苷在體內(nèi)可通過直接抑制病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用而發(fā)揮藥效。而MDCK細胞為非免疫細胞，因此黃芩苷和帕拉米韋的聯(lián)用沒有顯示協(xié)同效應(yīng)。近年來，研究證明流感病毒感染可引起機體過度免疫反應(yīng)，繼而引發(fā)免疫細胞和炎癥因子大量增殖并匯集肺部，毛細管通透性提高、白細胞滲出、肺水腫和氣道堵塞等炎癥連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致肺功能受損，以致人或動物死亡［22］。黃芩苷的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用有效減緩了病毒感染引發(fā)的動物呼吸道炎癥，而帕拉米韋通過抑制NA的活性而抑制病毒的增殖。兩者聯(lián)用顯著提高了感染小鼠的存活率及其平均存活時間。

綜上所述，黃芩苷與帕拉米韋聯(lián)合抗流感作用比單獨使用效果好，二者聯(lián)用可減少帕拉米韋的用量，從而減少其副作用及耐藥毒株的產(chǎn)生，在臨床上具有重要的應(yīng)用價值。

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