張?zhí)鹛穑钐扃?，王慶國，王 敏

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018）

鮮切蔬菜具有方便、營(yíng)養(yǎng)、新鮮、可食率高等特點(diǎn)，在發(fā)達(dá)國家廣受消費(fèi)者的歡迎[1-3]，也將是我國蔬菜供應(yīng)的發(fā)展方向之一。很多鮮切蔬菜品種，既可生食，又可加熱烹調(diào)食用。保證生食鮮切蔬菜的食用安全性是世界各國廣泛關(guān)注的重要研究課題。然而，至今尚沒有安全、有效的解決方法。過去10年[4]，鮮切蔬菜食源性致病菌導(dǎo)致的食品安全事件在發(fā)達(dá)國家也時(shí)有發(fā)生。鮮切蔬菜從田間生長(zhǎng)、采收及后續(xù)的運(yùn)輸、加工、包裝及貨架銷售過程中，均存在著食源性致病菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。前人的研究[5-8]多集中在避免污染和采后加工中，應(yīng)用二氧化氯、細(xì)菌素等化學(xué)或生物抗菌劑和低溫、氣調(diào)、輻照等物理方法控制食源性致病菌，從成品前食源性致病菌得到很好控制，但從市場(chǎng)銷售到食用前的過程中，少量的食源性致病菌仍有可能快速繁殖，使人致病。為此，食前徹底消除食源性致病菌是保證消費(fèi)者食用安全的最后且十分關(guān)鍵的措施，然而，過去的研究極少。食用前的處理，既可在酒店、餐廳等食品服務(wù)部門，也可在家庭進(jìn)行。熱處理是一種最廣泛應(yīng)用的物理殺菌方法，可以有效地殺死食源性致病菌[9-11]。前人也有在加工過程中，熱處理抑制鮮切蔬菜食源性致病菌的研究，然而由于殺死食源性致病菌的熱條件往往對(duì)鮮切蔬菜造成熱損傷，至今沒有得到應(yīng)用[12]。熱處理導(dǎo)致的熱損傷當(dāng)時(shí)可能不顯現(xiàn)，而在貯藏期或貨架期表現(xiàn)出來，但食用前熱處理則可避免這些后顯現(xiàn)的熱損傷，從而提高熱處理的強(qiáng)度和殺菌效果。我國民間有部分生鮮蔬菜食用前熱處理的做法，但這僅是經(jīng)驗(yàn)，缺少科學(xué)支持。本研究旨在探討食用前熱水處理徹底殺滅鮮切黃瓜上食源性致病菌，保證食用安全，又保持其鮮度的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所使用的黃瓜 購自山東省濟(jì)南市濟(jì)陽縣花園小區(qū)，選擇優(yōu)質(zhì)、無腐爛、無機(jī)械傷、大小均勻的黃瓜為材料，于10℃的冷庫中貯藏，24h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)菌株單增李斯特菌（ATCC 19111）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 13311），所用培養(yǎng)基Brain-Heart Infusion agar（BHIA，腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基）、PALCAM agar（PALCAM瓊脂培養(yǎng)基）和Hektoen Enteric agar（HE，腸道菌瓊脂培養(yǎng)基）及無菌均質(zhì)袋 均由北京陸橋技術(shù)有限公司提供。

YXQ-LS-SⅡ型立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；微量移液槍 上海宙輝生化儀器有限公司；BHC-1300IIA2型生物安全柜 蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司；PX-300B-G型微電腦光照培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HBM-400B型拍擊式均質(zhì)機(jī) 天津市恒奧科技有限公司；DDS-307型電導(dǎo)率儀 上海偉業(yè)儀器廠；TA-XT2i型物性測(cè)試儀 英國Stable Micro System公司；普析通用T6新世紀(jì)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Pocket refractometer Pal-1型手持糖量計(jì) 日本ATAGO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 實(shí)驗(yàn)分四部分進(jìn)行：a.熱水處理鮮切黃瓜并進(jìn)行感官評(píng)定；b.體外熱水處理食源性致病菌（鼠傷寒沙門氏菌和單增李斯特菌）；c.熱水處理染菌的鮮切黃瓜，并測(cè)定殘余致病菌數(shù)量；d.測(cè)定熱水處理對(duì)鮮切黃瓜品質(zhì)（硬度、細(xì)胞膜透性、可溶性固形物含量、抗氧化活性）的影響。

1.2.2 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜感官品質(zhì)的影響 將在本地市場(chǎng)上購買的新鮮黃瓜用清水洗凈，實(shí)驗(yàn)室條件（25℃）風(fēng)干，切成4～5mm厚的薄片，進(jìn)行表1所示處理，處理之后立即用20℃冷水冷卻1min，對(duì)鮮切黃瓜進(jìn)行感官評(píng)定。表1所示處理?xiàng)l件根據(jù)文獻(xiàn)資料[13]及熱水處理鮮切黃瓜的預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

表1 熱水處理鮮切黃瓜條件Table 1 Temperature and time of hot water treatments for fresh-cut cucumber

1.2.3 菌懸液制備及接種 無菌操作條件下，將致病菌接種于腦心浸液瓊脂平板上，于（37±1）℃培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)物，用無菌蛋白胨水（0.85%）將菌苔洗下，制成菌懸液，菌懸液濃度約為8log CFU/mL[14]。無菌操作條件下，將鮮切黃瓜在菌懸液中浸沾10min，風(fēng)干0.5h。

1.2.4 體外熱水處理食源性致病菌 將9mL無菌水加入到試管中，加熱至需要溫度，迅速加入1mL菌懸液，同時(shí)計(jì)時(shí)，達(dá)到需要的時(shí)間后取出，迅速用涼水（20℃）冷卻，不加熱的試管樣品作為對(duì)照。對(duì)于每一個(gè)處理，各自吸取1mL，加入到9mL 0.85%的無菌蛋白胨水中，制成10-2稀釋液，如此連續(xù)稀釋。

1.2.5 熱水處理接種的鮮切黃瓜 據(jù)1.2.2和1.2.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇熱水處理?xiàng)l件，在無菌條件下，對(duì)接種的鮮切黃瓜進(jìn)行熱水處理。處理完成后，每25g裝入一個(gè)無菌袋中，加入225mL無菌蛋白胨水，用均質(zhì)拍打機(jī)處理60s（6h/s），制成1∶10的樣品勻液。準(zhǔn)確吸取1∶10的樣品勻液1mL，放入裝有9mL 0.85%無菌蛋白胨生理鹽水的試管中迅速振搖，制成10-2濃度的稀釋液，如此連續(xù)稀釋。

1.2.6 食源性致病菌的計(jì)數(shù) 對(duì)于每一個(gè)樣品，選用合適的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。分別吸取100μL樣品液加到HE瓊脂培養(yǎng)基/PALCAM瓊脂培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布至干。每個(gè)稀釋度的樣品液涂布兩個(gè)平皿（如果某一樣品液在取出供試部分前的放置時(shí)間超過3min，應(yīng)按上述方法再振搖該樣品液）。

涂布完成后，翻轉(zhuǎn)平皿，于（36±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h。根據(jù)同一稀釋度的兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值或兩個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算出每克樣品中菌落數(shù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 鮮切黃瓜感官評(píng)定 鮮切黃瓜感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[7]如表2所示。

表2 鮮切黃瓜感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standard for organolrptic evaluation of fresh-cut cucumber

1.3.2 鮮切黃瓜細(xì)胞膜透性的測(cè)定 參考趙世杰等[15]方法，采集圓柱狀果肉，切成1mm厚組織圓片，50mL去離子水淋洗，吸干表面水分，裝入盛有15mL去離子水的具塞試管中，真空泵抽氣20min，25℃保溫1h，測(cè)定初電導(dǎo)值（S1）以及所用無離子水的電導(dǎo)（S0），測(cè)畢，置沸水浴10min，取出后在25℃水浴中平衡10min，搖勻，測(cè)終電導(dǎo)（S2）。相對(duì)電導(dǎo)率（L，%）=[（S1－S0）/（S2－S0）]×100。

1.3.3 鮮切黃瓜硬度測(cè)定 應(yīng)用TA-XT2i物性測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)定。

測(cè)定參數(shù)[16]為：測(cè)量模式：TPA；測(cè)量參數(shù)：測(cè)試前速度：1.0mm/s，測(cè)試速度：0.5mm/s，測(cè)試后速度：1.0mm/s，距離：1.0mm，時(shí)間：3.0s；探頭：P5（直徑5mm）。

1.3.4 鮮切黃瓜可溶性固形物含量測(cè)定 用日本ATAGO PAL-1數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)定。

1.3.5 鮮切黃瓜抗氧化活性測(cè)定 采用DPPH法測(cè)定，參照胡喜蘭等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Sigmaplot 12.1（Systat Software Inc，USA）統(tǒng)計(jì)作圖，方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)（LSD）用SPSS 16.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切黃瓜熱水處理?xiàng)l件的初步確定

由表1預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選鮮切黃瓜熱水處理?xiàng)l件見表3。由表3可以看出，熱水處理會(huì)降低鮮切黃瓜的感官品質(zhì)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇鮮切黃瓜硬度、顏色及口感評(píng)分都在4以上的熱水處理溫度及時(shí)間，進(jìn)行體外熱水處理食源性致病菌的實(shí)驗(yàn)。

表3 不同熱水處理?xiàng)l件對(duì)鮮切黃瓜感官品質(zhì)的影響Table 3 Effect of hot water treatment on organoleptic evaluation of fresh-cut cucumber

2.2 鮮切黃瓜熱水處理?xiàng)l件的最終確定

由圖1～圖2可以看出，體外熱水處理可以有效降低食源性致病菌的數(shù)量，60℃ 5min、70℃ 1min、70℃2min、80℃15s、80℃ 30s、85℃ 15s、85℃ 30s及90℃15s條件下，可減少鼠傷寒沙門氏菌的數(shù)量為2.53～4.87log CFU/mL，減少單增李斯特菌的數(shù)量為2.53～4.97log CFU/mL。溫度越高，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌和單增李斯特菌的滅殺效果越好；相同的溫度條件下，時(shí)間越長(zhǎng)滅殺效果越好。隨熱水處理?xiàng)l件的變化，兩種菌的變化趨勢(shì)一致。其中，90℃15s熱水處理?xiàng)l件效果最好，減少鼠傷寒沙門氏菌和單增李斯特菌的數(shù)目分別為4.87、4.97log CFU/mL。由此可以看出，與低溫較長(zhǎng)時(shí)間處理相比，高溫瞬時(shí)處理能更有效地殺滅食源性致病菌。結(jié)合感官品質(zhì)評(píng)定結(jié)果，選取60℃5min，70℃ 1min，70℃ 2min，80℃ 15s，85℃ 15s以及90℃15s作為鮮切黃瓜的熱水處理?xiàng)l件。

圖1 體外熱水處理對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的滅殺效果Fig.1 Inactivity of hot water treatment for S.Typhimurium in vitro

圖2 體外熱水處理對(duì)單增李斯特菌的滅殺效果Fig.2 Inactivity of hot water treatment for L.monocytogenes in vitro

2.3 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜上食源性致病菌的滅殺效果

由圖3～圖4可以看出熱水處理可以有效減少鮮切黃瓜表面食源性致病菌的數(shù)目，在初始染菌濃度為5.42log CFU/g的鼠傷寒沙門氏菌和5.16log CFU/g的單增李斯特菌條件下，常溫清水浸泡1min減少鼠傷寒沙門氏菌和單增李斯特菌的數(shù)目分別為0.43、0.02log CFU/g，熱水處理減少兩種菌的數(shù)目均≥0.77log CFU/g，其中，60℃ 5min及70℃ 2min熱水處理的鮮切黃瓜檢測(cè)不到鼠傷寒沙門氏菌的存在，同時(shí)60℃5min熱水處理也檢測(cè)不到單增李斯特菌的存在；而高溫瞬時(shí)熱水處理，如80℃ 15s，85℃ 15s和90℃15s對(duì)兩種食源性致病菌的滅殺效果明顯不如60℃ 5min，70℃ 1min和70℃ 2min熱水處理，說明與高溫短時(shí)間處理相比，低溫較長(zhǎng)時(shí)間熱水處理能更有效地減少鮮切黃瓜表面的食源性致病菌。

圖3 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜表面鼠傷寒沙門氏菌的滅殺效果Fig.3 Inactivity of hot water treatment for S.Typhimurium on fresh-cut cucumber

圖4 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜表面單增李斯特菌的滅殺效果Fig.4 Inactivity of hot water treatment for L.monocytogenes on fresh-cut cucumber

2.4 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜品質(zhì)的影響

相對(duì)電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，其值越大，表示電解質(zhì)的滲漏量越多，細(xì)胞膜受害程度越重[18]，由圖5可知熱水處理的鮮切黃瓜相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照樣品，說明熱水處理嚴(yán)重破壞了鮮切黃瓜的細(xì)胞膜，導(dǎo)致鮮切黃瓜品質(zhì)下降。

圖5 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of hot water treatment on relative electroconductibility

圖6和圖7中可以看出熱水處理對(duì)鮮切黃瓜的硬度和可溶性固形物含量影響不大，只有70℃ 2min熱水處理顯著降低了鮮切黃瓜的硬度值，其他處理樣品與對(duì)照之間沒有明顯差異。

圖6 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜硬度的影響Fig.6 Effect of hot water treatment on firmnessfirmness

圖7 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜可溶性固形物的影響Fig.7 Effect of hot water treatment on soluble solids

圖8可以看出，熱水處理顯著降低了鮮切黃瓜的抗氧化活性（損失58.47%～63.95%），熱水處理樣品之間的抗氧化活性值沒有明顯差別。

圖8 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜抗氧化值的影響Fig.8 Effect of hot water treatment on antioxidant activity

實(shí)驗(yàn)中采用DPPH法測(cè)定鮮切黃瓜抗氧化活性，綜上所述，60℃ 5min、70℃ 1min、70℃ 2min、80℃15s、85℃ 15s、90℃ 15s熱水處理會(huì)破壞鮮切黃瓜的細(xì)胞膜，降低其抗氧化活性，但對(duì)鮮切黃瓜的硬度和可溶性固形物含量影響不明顯（除70℃2min熱水處理顯著降低了樣品的硬度外）。

3 結(jié)論與討論

3.1 本研究結(jié)果表明，熱水處理顯著降低了鮮切黃瓜上和試管中鼠傷寒沙門氏菌和單增李斯特菌數(shù)量，但是熱水中實(shí)驗(yàn)與鮮切黃瓜的結(jié)果有所不同。體外熱水實(shí)驗(yàn)中，高溫短時(shí)間的熱水處理比較低溫度和較長(zhǎng)時(shí)間的熱水處理更能有效地減少食源性致病菌，而在熱水處理鮮切黃瓜上趨勢(shì)相反，可能的原因是長(zhǎng)時(shí)間的熱水處理能更有效地減少致病菌在鮮切黃瓜上的附著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Spinks等[19]的研究結(jié)果一致，55～65℃對(duì)清除致病菌是關(guān)鍵溫度范圍，并且支持了熱水操作體系最低溫度為60℃的理論。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱水處理顯著提高了鮮切黃瓜的相對(duì)電導(dǎo)率，降低了其抗氧化活性，但是除70℃2min熱水處理顯著降低了樣品的硬度外，其他條件均對(duì)鮮切黃瓜的硬度及可溶性固形物的含量沒有明顯的影響，而且感官品質(zhì)仍在可接受范圍，這說明適宜的熱水處理可以作為殺滅食源性致病菌，保持鮮度的技術(shù)措施。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，60℃5min熱水處理的鮮切黃瓜，食源性致病菌從高起始染菌量降低到檢測(cè)線以下，而且感官上仍然鮮脆。

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