曹文輝，王志耕，梅 林，薛秀恒

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽省乳品工程技術(shù)研究中心，安徽合肥230036）

酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPP）是以牛奶酪蛋白為原料，經(jīng)過蛋白酶水解，再分離純化之后得到的含有磷酸絲氨?；亩嚯摹Ｆ浠钚灾行氖浅纱牧姿峤z氨酸和谷氨酸簇，其核心結(jié)構(gòu)可表示為-Ser（P）-Ser（P）-Ser（P）-Glu-Glu-[1]。CPP具有促進(jìn)鈣、鐵和鋅等微量元素的吸收與利用，還具有抗氧化、促進(jìn)益生菌增殖等作用[2-7]，由于其穩(wěn)定性好、有多種生物活性因此具有相當(dāng)大的開發(fā)應(yīng)用潛力[8-9]。國外研究采用多種蛋白酶酶解酪蛋白，成功地制備出不同種類的CPP[10]，之后也有研究采用RP-HPLCESL-MS/MS方法成功地分離出12種CPP[11]。我國CPP的相關(guān)研究相對(duì)滯后，有研究采用反相C18液相制備色譜柱，制得了4種不同組分的CPP[12]，但在CPP的常規(guī)酶法制備方法上，研究基本以水解度為指標(biāo)，探討酪蛋白的單酶、多酶水解條件優(yōu)化，而以目標(biāo)產(chǎn)物CPP的得率為指標(biāo)進(jìn)行酶解條件優(yōu)化的研究開展較少。本文選擇具有可釋放CPP鏈段更短、產(chǎn)率高、含磷量高[13]等優(yōu)點(diǎn)的堿性蛋白酶為工具酶，以CPP的得率為指標(biāo)，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法相結(jié)合的方法，研究獲得較高CPP得率的酪蛋白水解液優(yōu)化條件，為CPP的有效制備提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白（高純級(jí)：95%） AMRESCO；堿性蛋白酶（Alkaline Protease） RUIBIO公司；其他試劑 均為分析純。

實(shí)驗(yàn)HJ-3型控溫磁力攪拌器、HH-S型恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；SJ-3F型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Allegra 64R CentrifugeBECKMAN COULTER。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶活的測定

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸100mg，逐步加入1mol/L鹽酸6mL使溶解。用0.2mol/L的鹽酸溶液溶解，定容至100mL，再配制成不同濃度的酪氨酸溶液。取不同濃度的酪氨酸溶液各1mL，分別加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5mL，酚試劑1mL。置于40℃恒溫水浴中顯色20min，用分光光度計(jì)在660nm處測吸光值，并同時(shí)做空白管（只加水、碳酸鈉和酚試劑）對(duì)照，以吸光值為縱坐標(biāo)，以酪氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 酶活力的測定 取3支試管，編號(hào)，各吸取2%的酪蛋白溶液1mL，在40℃水浴中預(yù)熱2min后加入同樣預(yù)熱的酶液（稀釋2000倍）1mL，立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)10min后，立即加入0.4mol/L三氯乙酸溶液2mL，保溫20min后，用濾紙過濾，取上清液。另取3支試管，編號(hào)，各加入上清液1mL，然后各加入0.4mol/L的碳酸鈉溶液5mL，混勻后再各加入酚試劑1mL。立即混勻，在40℃顯色20min。在660nm處測定吸光值。對(duì)照組測定方法同上，但在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。

規(guī)定在40℃和pH10.0的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生酪氨酸1μg為一個(gè)酶活力單位。

酶活力單位=（A樣-A對(duì)）×K/10×4×N 式（1）

式中，A樣為樣品液的吸光值；A對(duì)為對(duì)照液的吸光值；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線上吸光值為1時(shí)的酪氨酸微克數(shù)；10為酶促反應(yīng)時(shí)間（min）；4為所測溶液的體積數(shù)（mL）；N為酶液的稀釋倍數(shù)。

1.2.2 酪蛋白的水解 取一定量的酪蛋白，溶于60～70℃的一定濃度的堿性溶液中，配成一定底物濃度的酪蛋白，放入水浴鍋中，用0.5mol/L的NaOH調(diào)pH至實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)值，加入適量堿性蛋白酶，保溫至水解結(jié)束，沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，用2mol/L的HCl調(diào)pH至4.6，離心（8000r/min，10min）去除沉淀，取上清液。

1.2.3 CPP的制備 上述上清液→加10%的CaCl2使其終濃度為1.0%和2倍體積的無水乙醇→離心（8000r/min，10min）→取沉淀→烘干（80℃，4h）→稱重。

CPP得率（mg/mL）=（m2-m1）/v 式（2）

式中，m2為烘干之后稱量瓶和CPP的重量（mg）；m1為烘干之前稱量瓶的重量（mg）；v為所取1.2.2中上清液的體積數(shù)（mL）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 Plackett-Burman法篩選影響CPP得率的酶解主要因素 采用Plackett-Burman法，設(shè)計(jì)2水平實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素和水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.3.1的結(jié)果，影響CPP得率的酶解因素中溫度、pH、底物濃度、時(shí)間均為正效應(yīng)，應(yīng)增大，酶底比為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減小。其中溫度、pH、底物濃度三個(gè)因素影響較大。為此，確定酶解時(shí)間（4.5h）、酶底比（1.5%）為固定因子。因底物濃度的增大會(huì)使溶液的粘稠度相應(yīng)增大，過大的粘稠度會(huì)給實(shí)際操作造成難度，亦不利于工業(yè)化的生產(chǎn)。為此，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將底物濃度固定為11%，對(duì)溫度、pH兩個(gè)因素實(shí)施最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為：溫度起點(diǎn)50℃，變化步長為5℃；pH起點(diǎn)為10.5，變化步長為0.5。

1.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化水解條件 根據(jù)CCD響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用3因素5水平的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。

根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以第二組為中心點(diǎn)施行中心組合實(shí)驗(yàn)。因?yàn)橛?個(gè)自變量，為使擬合響應(yīng)方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，選擇中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)為6，星號(hào)臂長1.682。各自變量水平見表2。

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)的因素及水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels design of central composite experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照SB/T 10317-1999的方法測定蛋白酶的酶活力，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測定的結(jié)果，繪制吸光度值與酪氨酸濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線，如圖1所示。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Tyrosine

2.2 堿性蛋白酶的活力

為準(zhǔn)確確定酶的添加量，提高實(shí)驗(yàn)精度，對(duì)商品酶的活力進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)所選用的堿性蛋白酶的實(shí)測活力為35348U/g。

2.3 影響CPP得率的酶解主要因素

Plackett-Burman法篩選酶解酪蛋白獲得CPP的主要因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，影響CPP得率的5個(gè)因素中，溫度、pH、底物濃度、時(shí)間對(duì)CPP的得率表現(xiàn)為正效應(yīng)（Exi＞0），應(yīng)增大，酶底比對(duì)CPP的得率表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)（Exi＜0），應(yīng)減小。影響CPP得率的最主要的三個(gè)因素為：底物濃度、溫度、pH確定酶底比為1.5%，時(shí)間4.5h。故確定可選取這三個(gè)因素進(jìn)行下一步的優(yōu)化。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 The Plackett-Burman exprimental design and results

2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，第二組的CPP得率最高，故選擇第二組作為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of steepest ascent path

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化水解條件

CCD響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)的中心組合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表5。

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of central composite experiments

根據(jù)表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：

Y=26.97+0.26X1+4.49X2+0.61X3-0.24X1X2-0.37X1X3-0.36X2X3-0.86X12-0.87X22-0.52X32。

回歸方程的模型顯著性分析、失擬顯著性分析以及回歸系數(shù)顯著性分析見表6。

表6 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 6 Variance analysis of fitted quadratic polynomial model

從表6的結(jié)果分析中可以看出，模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)（R2）為0.9844，校正系數(shù)（R2Adj）為0.9703，說明該回歸模型與實(shí)際值擬合程度高。回歸模型中一次項(xiàng)中的X2、X3和二次項(xiàng)表現(xiàn)顯著，一次項(xiàng)中的X1和交互項(xiàng)表現(xiàn)不顯著。利用軟件得到的響應(yīng)面圖見圖2～圖4。

圖2 底物濃度和溫度對(duì)CPP得率的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface of substrate concentration andtemperature on the extraction rate of CPP

從圖2中可以看出，底物濃度對(duì)CPP得率的影響曲線呈不斷上升的趨勢(shì)，溫度對(duì)CPP得率的影響曲線較平緩。結(jié)合圖2及表6中的方差分析，底物濃度對(duì)CPP得率的影響顯著（p＜0.01）；在實(shí)驗(yàn)設(shè)定溫度范圍內(nèi)，溫度對(duì)CPP得率的影響不顯著（p＞0.05）；底物濃度和溫度的交互作用對(duì)CPP得率的影響不顯著（p＞0.05）。

圖3 pH和溫度對(duì)CPP得率的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface of pH and temperature on the extraction rate of CPP

從圖3中可以看出，pH對(duì)CPP得率的影響曲線呈現(xiàn)先快速上升后略有下降的趨勢(shì)，溫度對(duì)CPP得率的影響曲線呈現(xiàn)先上升后略有下降的趨勢(shì)。結(jié)合圖3及表6中的方差分析，pH對(duì)CPP得率的影響顯著（p＜0.01）；溫度對(duì)CPP得率的影響不顯著（p＞0.05）；pH和溫度的交互作用對(duì)CPP得率的影響亦不顯著（p＞0.05）。

圖4 pH和底物濃度對(duì)CPP得率的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface of pH and substrate concentration on the extraction rate of CPP

從圖4中可以看出，底物濃度對(duì)CPP得率的影響曲線呈不斷上升的趨勢(shì)，pH對(duì)CPP得率的影響曲線較平緩。結(jié)合圖4及表6中的方差分析，pH對(duì)CPP得率的影響顯著（p＜0.01）；底物濃度對(duì)CPP得率的影響顯著（p＜0.01），且底物濃度對(duì)CPP得率的影響大于pH對(duì)CPP得率的影響；底物濃度和pH的交互作用對(duì)CPP得率的影響亦不顯著（p＞0.05）。

2.6 模型的驗(yàn)證

利用軟件求解回歸方程，得到最佳CPP得率的工藝條件為：溫度54.16℃、底物濃度16.3%、pH10.87，在此條件下得到的CPP得率為32.8mg/mL。考慮到實(shí)際操作的情況，將工藝條件調(diào)整為：溫度55℃、底物濃度16%、pH10.8，在酶底比1.5%、時(shí)間4.5h的情況下，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)CPP得率為33.2mg/mL，實(shí)際值與預(yù)測值之間相對(duì)誤差為1.22%，在可接受范圍。

3 討論

現(xiàn)有一些研究結(jié)果表明，酪蛋白酶解過程中，CPP的釋放與水解度只呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)酪蛋白水解度達(dá)到16%時(shí)，大部分CPP已釋放出來，所以在CPP生產(chǎn)過程中可不必使水解度達(dá)到最大值[14]。有鑒于此，本研究嘗試采用CPP的得率為指標(biāo)進(jìn)行條件優(yōu)化，取得較好結(jié)果，最優(yōu)條件下，可獲得33.2mg/mL濃度得率的CPP，表明這一路徑是可行的，但與現(xiàn)行水解度為指標(biāo)的技術(shù)方案優(yōu)劣的系統(tǒng)比較研究尚有待進(jìn)行。

在本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，圖2溫度對(duì)CPP得率的影響和圖4中pH對(duì)CPP得率的影響的響應(yīng)面變化趨勢(shì)基本一致，這與方差分析結(jié)果：溫度對(duì)CPP得率的影響不顯著、pH對(duì)CPP得率的影響顯著不一致。分析認(rèn)為，可能是因?yàn)榈孜餄舛葘?duì)CPP得率的影響效應(yīng)較大，從而掩蓋了pH對(duì)CPP得率的影響。為此，可以采用固定底物濃度（使CPP有較高的得率且不會(huì)產(chǎn)生過大的粘稠度給實(shí)際操作造成難度）的方式，優(yōu)化CPP得率的其他影響因素，這有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

底物濃度、溫度和pH是影響堿性蛋白酶酶解酪蛋白制備CPP得率的主要因素，其最優(yōu)水解條件為：溫度55℃、底物濃度16%、pH10.8、酶底比1.5%，時(shí)間4.5h，在此條件下，水解所得到的CPP得率為33.2mg/mL。

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