劉 萌，黃曉杰，馬圓圓，趙卉雙

（遼寧醫(yī)學院食品科學與工程學院，遼寧錦州121001）

乳蛋白肽是乳蛋白水解后的產(chǎn)物，具有獨特的加工特性和多種生理特性，水解使埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露出來與味蕾接觸，從而產(chǎn)生苦味。目前苦味肽的脫除方法主要有分離法、掩埋法和生物酶解法等[1]。近年來，使用肽酶來減弱或消除苦味的研究較多，但肽酶價格較高，尚未在食品行業(yè)中大規(guī)模使用。許多微生物存在一定的產(chǎn)酶系統(tǒng)，有能力將苦味肽進一步水解，使苦味下降甚至完全消失。微生物分布廣、種類多、代謝旺盛、繁殖快，無疑給脫苦的產(chǎn)業(yè)化鏈條提供了一種可能。本實驗擬通過篩選得到脫苦效果佳的菌株，并將其應(yīng)用于乳飲料的脫苦。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母干粉 大連工業(yè)大學提供；直投式凍干乳酸菌復合菌種（由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳酸桿菌復合） 黑龍江八一農(nóng)墾大學提供；土豆汁培養(yǎng)基 去皮切塊土豆200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH至6.8，于121℃滅菌20min，培養(yǎng)24h鏡檢確定無菌生長后方可使用。

TGL-16G型高速離心機 上海安亭科學儀器廠；紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；PHS-3CW型精密酸度計 上海江儀儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳蛋白肽飲料制備工藝 牛乳→加酶→調(diào)節(jié)pH→調(diào)節(jié)溫度恒溫水解→滅酶（100℃，5min）→調(diào)味→灌裝→殺菌。

參照白振宇[1]的酶解工藝，略作修改。將一定量的脫脂牛乳加入到50mL燒杯中，用蒸餾水適當稀釋，以5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5在水浴鍋中加熱攪拌，加入木瓜、菠蘿復合蛋白酶（酶與底物質(zhì)量比為4%，復合比例1∶1），60℃保溫水解3h，后加入胰蛋白酶（酶與底物質(zhì)量比為5%），40℃水解3h。

1.2.2 微生物脫苦實驗

1.2.2.1 乳酸菌脫苦實驗 分別添加0.1%、0.5%、1%、2%、3%的直投式凍干乳酸菌于乳蛋白肽，于42℃培養(yǎng)5、7、9h，測定酶解脫苦后溶液的理化指標。

1.2.2.2 酵母菌脫苦實驗 將釀酒酵母制成懸液，用劃線分離法在平板上分離培養(yǎng)，經(jīng)鏡檢確認純化后，將酵母菌接種在含亞硒酸鈉的斜面培養(yǎng)基上，活化2～3代。然后將斜面菌種接種到液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)。分別添加0.1%、0.5%、1%、2%、3%的酵母菌于乳蛋白肽，于42℃培養(yǎng)5、7、9h，測定酶解脫苦后溶液的理化指標。

1.2.2.3 復合菌脫苦實驗 分別添加0.5%、1%、2%的復合菌（復合比例分別選擇，乳酸菌∶酵母菌為2∶1，1∶1和1∶2），于42℃培養(yǎng)7h，考察乳酸菌、酵母菌復合的脫苦效果。

1.3 理化指標測定

1.3.1 總蛋白酶活力 取0.4mL酶液，加入2.0mL 1%的酪蛋白-PBS緩沖液（pH7.6），37℃溫育10min后，立即加入10%三氯乙酸2.0mL，混勻、中止反應(yīng)，4500×g離心20min，取上清液測275nm處吸光度值A(chǔ)。以空白生理鹽水作對照。用酪氨酸標準物做酪氨酸標準曲線，利用吸光度A在標準曲線上求出蛋白酶釋放出的酪氨酸濃度，從而推導出總蛋白酶活力。

總蛋白酶活力單位定義為：每克內(nèi)容物37℃每分鐘每增加1μmol酪氨酸為1個活力單位?？偟鞍酌富盍τ嬎愎饺缦拢?/p>

總蛋白酶活力（U/mL）=A×K×N×4/10

式中，A—樣品平行實驗的平均吸光度，K—當吸光度為1時的酪氨酸的量，μmol；N—酶液的稀釋倍數(shù)；4—4mL反應(yīng)液；10—反應(yīng)時間10min。

1.3.2 短肽得率

1.3.2.1 可溶性氮的測定 將酶解液與質(zhì)量分數(shù)20%的三氯乙酸以1∶1比例混合，4500r/min離心10min后取上清液采用Folin-酚法測定。

1.3.2.2 短肽得率的測定 三氯乙酸可溶性氮法[2]

式中，TCA-SNI—三氯乙酸可溶性氮，%；N1—在20%三氯乙酸中的可溶性氮，mg；N0—原料中總氮，mg。

原料中總氮的測定方法采用凱氏定氮法。

1.3.3 苦味值的測定 對脫苦處理前后短肽苦味的評價采用與未經(jīng)脫苦處理的苦味短肽溶液相比對的方法：將未經(jīng)脫苦處理的苦味短肽溶液的濃度分別配為20%、40%、60%、80%和100%（即未稀釋），其苦味分別定級為1至5，感官品評小組以此標準評價脫苦后產(chǎn)品。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌脫苦效果

2.1.1 乳酸菌發(fā)酵對總蛋白酶活的影響 乳酸菌代謝產(chǎn)生的肽酶可水解疏水性氨基酸，從而起到脫苦的效果。乳酸菌接種量和培養(yǎng)時間對總蛋白酶活的影響見圖1。由圖1可以看出，乳酸菌培養(yǎng)時間由5h增加到7h，總蛋白酶活性明顯提高；培養(yǎng)時間大于7h后，蛋白酶活增加不明顯，后續(xù)實驗選擇培養(yǎng)7h。

由圖1可以看出，乳酸菌接種量過低或過高，總蛋白酶活值都較低。乳酸菌接種量為0.5%時，總蛋白酶活最高，繼續(xù)增加接種量，總蛋白酶活性降低，這是因為乳酸菌產(chǎn)生的其他蛋白酶和酶解產(chǎn)物進一步反應(yīng)的結(jié)果[3]。

圖1 乳酸菌接種量和培養(yǎng)時間對總蛋白酶活的影響Fig.1 Effect of lactobacillus inoculation and fermentation time on total protease activity

2.1.2 乳酸菌發(fā)酵對TCA-SNI和苦味值的影響 乳酸菌接種量對TCA-SNI和苦味值的影響見圖2。由圖2可以看出，隨著乳酸菌添加量的增加，苦味值減小，添加量為0.5%～2%時苦味值最低，添加量2%～3%苦味值增大，這是因為接種量過大，乳酸菌產(chǎn)生的其他蛋白酶和酶解產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生特殊苦味物質(zhì)的結(jié)果。而添加量為0.1%～0.5%時，TCA-SNI隨著添加量的增加而增大，在0.5%時TCA-SNI值最高，隨后逐漸降低，這可能是因為生成的短肽被繼續(xù)水解為游離氨基酸的結(jié)果，綜合考慮0.5%的添加量較為適宜。

圖2 乳酸菌接種量對TCA-SNI和苦味值的影響Fig.2 Effect of lactobacillus inoculation on TCA-SNI and bitter value

2.2 酵母菌脫苦效果

2.2.1 酵母菌發(fā)酵對總蛋白酶活的影響 酵母菌接種量和培養(yǎng)時間對總蛋白酶活的影響見圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時間的延長，總蛋白酶活逐漸增加，7h后趨于穩(wěn)定。酵母菌接種量為0.1%時總蛋白酶活含量最低，增加接種量達0.5%時，總蛋白酶活達到較高水平，繼續(xù)增加接種量，總蛋白酶活增加不明顯甚至降低。結(jié)合圖1、圖3可知，酵母菌培養(yǎng)的總蛋白酶酶活明顯高于乳酸菌。

圖3 酵母菌接種量和培養(yǎng)時間對總蛋白酶活的影響Fig.3 Effect of yeasts inoculation and fermentation time on total protease activity

2.2.2 酵母菌發(fā)酵對TCA-SNI和苦味值的影響 酵母菌接種量對TCA-SNI和苦味值的影響見圖4。由圖4可知，隨著添加量的增加，苦味值先降低后增加，在0.5%添加量時脫苦效果最佳，此時TCA-SNI也較高，隨著發(fā)酵的進行TCA-SNI值先增加后緩慢下降。釀酒酵母的脫苦效果優(yōu)于乳酸菌，這是由于乳酸菌代謝的肽酶屬于胞內(nèi)酶，而釀酒酵母菌在細胞壁存在若干種端肽酶[3]。

圖4 酵母菌接種量對TCA-SNI和苦味值的影響Fig.4 Effect of yeasts inoculation on TCA-SNI and bitter value

2.3 復合菌脫苦效果

2.3.1 復合菌發(fā)酵對總蛋白酶活的影響 結(jié)果如圖5所示，從圖5中可以看出，兩種菌有共生作用，混合培養(yǎng)產(chǎn)酶快；當添加量超過0.5%時，總蛋白酶活增加明顯；繼續(xù)增加添加量，總蛋白酶活增加不明顯，這是因為接種量過大，菌體產(chǎn)生的其他蛋白酶增多并和酶解產(chǎn)物進一步反應(yīng)。菌種的復合比例對總蛋白酶活的影響不大，復合菌接種量為1.0%時，總蛋白酶活最高達到32U/mL，這與曾少葵[4]的研究一致。

圖5 不同添加量、復合比例對總蛋白酶活的影響Fig.5 Effect of inoculation and proportion of composite bacteria on total protease activity

2.3.2 復合菌發(fā)酵對TCA-SNI的影響 不同添加量、復合比例對TCA-SNI的影響見圖6。由圖6可以看出，乳酸菌、酵母菌的復合比例對TCA-SNI值的影響不大，其中酵母菌所占比例大，TCA-SNI值略有提高。添加量為1%時，TCA-SNI值較高，最大值達到34.5%。結(jié)合圖2、圖4可以看出，復合菌發(fā)酵的TCASNI值明顯高于單獨菌種發(fā)酵，這是由于酵母菌脫苦需和其他微生物聯(lián)合使用，先用內(nèi)切酶（乳酸菌）將完整的大蛋白分子水解成肽鏈，再用酵母菌產(chǎn)生的端肽酶將疏水性氨基酸殘基切除，TCA-SNI值升高[5]。

圖6 不同添加量、復合比例對TCA-SNI的影響Fig.6 Effect of inoculation and proportion of composite bacteria on TCA-SNI

2.3.3 復合菌發(fā)酵對苦味值的影響 由圖7可以看出，兩種菌復合后發(fā)酵苦味值較單一菌種發(fā)酵降低，改善了乳蛋白肽飲料的風味，混合菌種的脫苦效果好于單一菌種，1%復合菌接種量的脫苦效果好于0.5%和2%的復合菌接種量，苦味值為0.5。添加量1%～2%時，混合比例對乳蛋白肽飲料苦味影響不大；添加量0.5%時混合比例對乳蛋白肽飲料苦味有一定影響。

圖7 不同添加量、復合比例對苦味值的影響Fig.7 Effect of inoculation and proportion of composite bacteria on bitter value

3 結(jié)論

乳酸菌、酵母菌均具有一定的脫苦效果，這是由于二者代謝產(chǎn)生的肽酶水解疏水性氨基酸的作用。實驗結(jié)果表明，乳酸菌和酵母菌的復合菌按1%的添加量接種，TCA-SNI值較大，脫苦效果優(yōu)于單一菌種的發(fā)酵效果。添加量1%～2%時，混合比例對乳蛋白肽飲料苦味影響不大；添加量0.5%時混合比例對乳蛋白肽飲料苦味有一定影響。

[1]白振宇.牛奶中主要過敏原的消除及檢測技術(shù)的研究[D].天津：天津商業(yè)大學，2007：12-19.

[2]何慧，王進，裴凡，等.蛋白水解物與苦味的構(gòu)效關(guān)系及脫苦研究[J].食品科學，2006，27（10）：571-574.

[3]孟雅瀟.乳蛋白酶解肽苦味脫除工藝研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2008.

[4]孟雅瀟，呂加平，周俊.乳蛋白肽微生物脫苦的研究概述[J].中國乳品工業(yè)，2008，36（3）：38-41.

[5]曾少葵，楊萍，陳秀紅.微生物發(fā)酵對羅非魚下腳料蛋白酶解液脫腥去苦效果比較[J].南方水產(chǎn)，2009，5（4）：58-63.