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        兩種苦瓜藤多糖提取工藝的比較分析

        2013-12-06 07:14:14曾哲靈奚光興葛曉環(huán)
        食品工業(yè)科技 2013年10期
        關(guān)鍵詞:苦瓜熱水超聲波

        曾哲靈,奚光興,葛曉環(huán)

        (1.南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌330047;2.南昌大學環(huán)境與化學工程學院,江西南昌330031;3.南昌大學生命科學與食品工程學院,江西南昌330031)

        苦瓜又名涼瓜,是葫蘆科植物,為一年生攀緣草本。苦瓜的多個部位都能入藥,苦瓜藤能清熱解毒,治痢疾、瘡毒、胎毒、牙痛。《四川中藥志》就有記載:“性涼,味苦,無毒?!比肫?、胃二經(jīng)??喙虾卸喾N有效成分,其中苦瓜多糖藥用價值很高,具有提高免疫力、降血糖、抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抑制艾滋病毒HIV的表面活性等作用[1-7]。常見的多糖提取方法有熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法、酶法等[8-13]。熱水浸提法是一種比較普遍的天然有機物的提取方法,但是耗能費時,且對熱敏性的天然物質(zhì)具有一定的破壞作用,是一種局限性非常大的提取方法;而酸堿提法對有機物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞性比較強,也不利于天然物質(zhì)的開發(fā)利用;酶法提取則成本較高,難以回收利用。因此,有必要開發(fā)一種高效、節(jié)能、綠色的多糖提取方法。天然植物的有效成分大多為細胞內(nèi)物質(zhì),提取時需將植物細胞破碎,現(xiàn)有的機械破碎法難以實現(xiàn)細胞的有效破碎,化學方法容易造成被提取物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化,因而很難達到理想效果。超聲波提取技術(shù)逐漸興起,其操作簡單快速、多糖提取率高、速度快、效果好,且多糖結(jié)構(gòu)被破壞作用小的優(yōu)勢日益突出。超聲波提取應(yīng)用于多種多糖的提取也早有報道,但其應(yīng)用于苦瓜藤多糖的提取卻未見報道。本文優(yōu)化了超聲波提取苦瓜藤多糖的工藝條件,并與傳統(tǒng)方法作比較,以期得出一個最優(yōu)的苦瓜藤多糖提取工藝參數(shù),為進一步研究苦瓜藤多糖的藥效和結(jié)構(gòu)組成提供一定的理論支持,促進苦瓜藤的開發(fā)利用。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        苦瓜藤 購自農(nóng)村;牛血清蛋白 購自美國Sigma公司;葡萄糖、考馬斯亮藍G-250、磷酸、苯酚、濃硫酸、鹽酸溶液、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑 皆為國產(chǎn)分析純。

        KQ5200E型超聲波清洗器(40KHZ,200W) 昆山超聲儀器有限公司;HH恒溫水浴箱 中大儀器廠;765pc型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 苦瓜藤多糖的提取工藝流程 新鮮的苦瓜藤曬干后,剪成2~3cm的小段,粉碎機粉碎,60℃條件下烘干至無游離水,取一定量的苦瓜藤藤粉末,按一定條件超聲波提取后,離心取上清液,過濾,50℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮提取液,加入4倍體積的無水乙醇,4℃下醇沉8~12h,醇沉兩次,離心,乙醚洗滌,烘干,得苦瓜藤粗多糖。

        1.2.2 葡萄糖標準曲線的制備[14-15]準確稱取105℃烘至恒重的葡萄糖標品1g,蒸餾水定容至1L,移取2mL,用25mL的容量瓶定容,得0.08mg/mL葡萄糖標液。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL葡萄糖標液于25mL比色管中,補足蒸餾水至2.0mL,加1.0mL 6%苯酚,再加入5.0mL濃硫酸,搖勻,靜置冷卻至室溫,在490nm處測定吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線。葡萄糖含量與吸光度值經(jīng)回歸處理,回歸方程為:A=14.373C-0.0133,R2=0.9969(n=8),糖含量在8~64μg線性良好,見圖1。

        圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

        1.2.3 苦瓜藤多糖得率的測定[16]取提取液上清液,過濾,定容至250mL,分別吸取0.1mL提取液,補足水至2.0mL,測定吸光度值,根據(jù)測得的吸光度值A(chǔ),參照葡萄糖標準曲線,計算出多糖濃度,進而得到得率。

        1.2.4 超聲波提取單因素實驗

        1.2.4.1 提取溫度 準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份,料液比為1∶40(g/mL),pH為7,分別取30、40、50、60、70℃,超聲提取20min,離心取上清液,過濾,計算多糖得率,每個因素做四個平行。

        1.2.4.2 料液比 準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份,溫度為60℃,pH為7,料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL),超聲20min,余下操作如1.2.4.1。

        1.2.4.3 提取時間 準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份,溫度為60℃、料液比1∶30(g/mL),pH為7,分別超聲10、20、30、40、50min,之后操作如1.2.4.1。

        1.2.4.4 pH 準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份,溫度60℃、料液比1∶30(g/mL)、超聲時間30min,研究不同pH條件3、5、7、9、11下的多糖提取得率,余下操作如1.2.4.1。

        1.2.5 苦瓜藤多糖超聲波提取的正交實驗設(shè)計[17]在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行L9(34)正交實驗,因素水平表見表1。

        表1 超聲波提取苦瓜藤多糖正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design of ultrasound-assisted extraction

        1.2.6 熱水提取法單因素實驗 設(shè)計熱水提取法單因素實驗,并優(yōu)化工藝,比較分析兩種提取方法的優(yōu)劣。以料液比、提取時間、提取溫度這3個單因素為研究目標。

        1.2.6.1 料液比 準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份,溫度70℃,料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL),熱水提取90min,之后操作如1.2.4.1。

        1.2.6.2 時間 準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份,溫度70℃、料液比1∶50(g/mL),分別浸提30、60、90、120、150min,之后操作如1.2.4.1。

        1.2.6.3 溫度 準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份,料液比1∶50(g/mL)、浸提時間90min,分別在50、60、70、80、90℃條件下提取,之后操作如1.2.4.1。

        1.2.7 苦瓜藤多糖熱水提取的正交實驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,設(shè)計L9(33)正交實驗,因素水平表見表2。

        表2 熱水提取苦瓜藤多糖正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels in orthogonal array design of hot-water extraction

        1.2.8 超聲波提取法與熱水提取法的比較 分別取5.0g苦瓜藤粉末2份,分別用超聲波與熱水提取的最佳工藝各提取2次,測定其多糖濃度,得出多糖得率,比較兩種方法的提取效率。

        1.3 統(tǒng)計分析

        各組實驗數(shù)據(jù)平行4次,結(jié)果以平均值±標準偏差的形式表示。數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism(5.01版)進行分析,結(jié)果顯示單因素數(shù)據(jù)的p值<0.05,具有統(tǒng)計顯著性。采用正交助手Ⅱ(3.1版)對正交實驗結(jié)果進行直觀、極差和顯著性分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 超聲波提取實驗結(jié)果

        2.1.1 單因素實驗結(jié)果

        2.1.1.1 提取溫度對苦瓜藤多糖得率的影響 由圖2可見,苦瓜藤多糖得率隨著溫度的升高而上升,但到達60℃時趨于平緩,考慮到在高溫下部分多糖分子會發(fā)生鍵的斷裂,結(jié)構(gòu)破壞,其活性會遭到破壞。同時過高的溫度對設(shè)備要求較高,耗能大,故溫度選在60℃為宜。

        圖2 溫度對苦瓜藤多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasound extracting temperature on the polysaccharide yield

        2.1.1.2 料液比對苦瓜藤多糖得率的影響 由圖3可知,苦瓜藤多糖的得率隨著料液比先增高后下降,在1∶30(g/mL)達到最大。1∶30(g/mL)以后提取率下降的原因,可能是料液比過大,會增加超聲波破碎細胞的阻力,使細胞破碎程度下降,降低多糖的提取率;如果料液比過小,又沒有足夠的水溶解出苦瓜藤多糖,也會使提取率降低[18]。故料液比宜取1∶30(g/mL)。

        圖3 料液比對苦瓜藤多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound ratio of solid to liquid on the polysaccharide yield

        2.1.1.3 超聲時間對苦瓜藤多糖得率的影響 由圖4可知,隨著時間的增長,提取率逐漸上升,到30min時達到最大,時間再增加時提取率又會下降,造成這一現(xiàn)象的原因可能是超聲波作用的時間過長,也會使得部分多糖的高分支結(jié)構(gòu)受到破壞,使其溶于水的特性消失[18],從而降低了多糖提取率。故時間宜取30min。

        圖4 超聲時間對苦瓜藤多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound extraction time on the polysaccharide yield

        2.1.1.4 pH環(huán)境對苦瓜藤多糖得率的影響 由圖5可見,多糖得率隨著pH增加而升高,可見多糖在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定,結(jié)構(gòu)易變化,或分解,造成提取率降低,而在堿性環(huán)境下比較穩(wěn)定,但是,過堿的環(huán)境對多糖的品質(zhì)會有一定的影響,且多糖得率從pH為7時增幅就不大,故pH宜取7。

        圖5 pH對苦瓜藤多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasound extraction pH on the polysaccharide yield

        2.1.2 超聲波提取正交實驗結(jié)果 超聲波提取苦瓜藤多糖正交實驗結(jié)果見表3。

        由表3可知,四因素對苦瓜藤多糖得率的影響大小為:A>C>D>B,即溫度>超聲時間>pH>料液比。其最佳提取工藝參數(shù)為A3B3C3D3,但由于pH和料液比為次要因素,為節(jié)約成本考慮,調(diào)整pH為7,料液比為1∶30(g/mL),其組合為A3B2C3D2。與A3B3C3D3做驗證性比較,結(jié)果表明,A3B2C3D2的得率為2.36%,A3B3C3D3得率為2.38%,而表中A3B1C3D2的得率為2.35%。由此可見,從提取率和能源節(jié)約兩方面綜合考慮,A3B1C3D2可為最優(yōu)提取工藝。根據(jù)最優(yōu)提取工藝分別提取1、2、3次,結(jié)果表明,一次提取率為2.35%,兩次提取混合液為提取率為3.08%,三次提取混合液為3.44%,三次提取增幅很小,出于經(jīng)濟因素考慮,取2次提取為宜,因此,超聲提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為:提取溫度65℃、料液比1∶25(g/mL)、超聲時間35min、pH為7,浸提2次。

        表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Orthogonal array design results of ultrasound-assisted extraction

        2.2 熱水提取實驗結(jié)果

        2.2.1 單因素實驗結(jié)果

        2.2.1.1 料液比對苦瓜藤多糖得率的影響 由圖6可知,苦瓜藤多糖的得率隨著料液比先增高后下降,在1∶50(g/mL)達到最大。1∶50(g/mL)以后提取率略有下降,如果料液比過小,又沒有足夠的水溶解出苦瓜藤多糖,也會使提取率降低。故料液比宜取1∶50(g/mL)。

        圖6 料液比對苦瓜藤多糖得率的影響Fig.6 Effect of ratio of solid to liquid on the polysaccharide yield

        2.2.1.2 浸提時間對苦瓜藤多糖得率的影響 由圖7可知,隨著時間的增長,提取率逐漸上升,到90min時達到最大,時間再增加時提取率又會下降,造成這一現(xiàn)象的原因可能是熱提時間會使得部分多糖的高分支結(jié)構(gòu)受到破壞,使其溶于水的特性消失,從而降低了多糖提取率[18]。故時間宜取90min。

        圖7 熱提時間對苦瓜藤多糖得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on the polysaccharide yield

        2.2.1.3 提取溫度對苦瓜藤多糖得率的影響 由圖8可見,苦瓜藤多糖得率隨著溫度的升高而先升后降,在70℃時提取率最高,在高溫下部分多糖分子會發(fā)生鍵的斷裂,結(jié)構(gòu)破壞,其活性會遭到破壞[19],故溫度選在70℃為宜。

        圖8 浸提溫度對苦瓜藤多糖得率的影響Fig.8 Effect of extracting temperature on the polysaccharide yield

        2.2.2 熱提法正交實驗結(jié)果 熱水提取苦瓜藤多糖正交實驗結(jié)果見表4。

        表4 正交實驗結(jié)果Table 4 Orthogonal array design results of ultrasound-assisted extraction

        由表4可知,三因素對苦瓜藤多糖得率的影響大小為B>A>C,即料液比>浸提溫度>浸提時間,其最佳提取工藝參數(shù)為A3B3C2。結(jié)果表明,A3B3C2的得率為2.30%,在九組實驗中最大,表明A3B3C2可為最優(yōu)提取工藝。根據(jù)最優(yōu)提取工藝分別提取1、2、3次,結(jié)果顯示,第一次提取率可達2.30%,二次提取混合液3.06%,三次提取混合液為3.43%,兩次提取比較完全,三次提取增幅不大,因此,熱水提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為:提取溫度75℃、料液比1∶55(g/mL)、提取時間90min,浸提2次。

        2.3 超聲波提取法與熱水提取法的比較

        在各自的最佳工藝條件下,超聲波提取35min提取率能達到2.35%,熱水提取90min提取率為2.30%。由此與熱水提法相比,超聲波提取法節(jié)約了將近60%的時間,效率約為水提法的2.5倍;兩種方法的兩次提取總量相當,說明第二次提取時細胞粉碎程度比較完全,超聲波的影響已經(jīng)不太顯著,但總的來說,提取液的用量和提取溫度也比熱水提取法少的多,符合綠色節(jié)能的發(fā)展要求。

        3 結(jié)論

        通過本實驗的研究,得出苦瓜藤多糖超聲提取的最優(yōu)工藝為:提取溫度65℃、料液比1∶25(g/mL)、超聲時間35min、pH為7,浸提2次,四因素對苦瓜藤多糖得率的影響大小為:溫度>超聲時間>pH>料液比。熱水提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為:提取溫度75℃、料液比1∶55(g/mL)、提取時間90min,浸提2次,三因素對苦瓜藤多糖得率的影響大小為:料液比>浸提溫度>浸提時間。

        通過兩種提取法的最佳工藝的比較發(fā)現(xiàn),超聲波提取法的效率約是傳統(tǒng)熱水提取法的2.5倍,驗證了超聲波提取的高效性。由單因素的結(jié)果可以看出,苦瓜藤多糖對熱、酸不是很穩(wěn)定,所以提取苦瓜藤多糖時要避免高溫、加熱過久,pH環(huán)境不可過酸,以便得到較多和較穩(wěn)定的多糖??喙咸俅痔呛泻芏嘟M分,這些都有待進一步研究。

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