李作美，柯春林，曾曉雄

(1.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095)

鼎湖鱗傘(Pholiota dinghuensis Bi)是一種大型真菌，位于廣東鼎湖山慶云寺附近，生境在闊葉林中凸脈榕和韶子活樹干上或基部群生、簇生［1］。該種為中國特有種［2］。食藥用真菌作為藥物在我國已經(jīng)具有悠久的歷史，早在兩千多年前的東漢末期，世界上第一部藥物專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中就記載了靈芝、茯苓、豬苓等真菌的藥用功效［3］。明代著名的醫(yī)藥學(xué)家李時珍編著的《本草綱目》，載藥1892種，據(jù)不完全統(tǒng)計，其中有藥用真菌40余種，如香菇、馬勃、豬苓、茯苓、木耳等，并進行了簡單的分類，將真菌藥材大部分收載于菜部卷中，說明他那時就已注意到有些藥用真菌同時具有食用價值［3－4］。經(jīng)大量研究表明，絕大多數(shù)真菌多糖都具有免疫調(diào)節(jié)作用［5－7］。如銀耳多糖、靈芝多糖、香菇多糖等的免疫調(diào)節(jié)活性比較明顯。新疆阿魏菇能有效增強小鼠的體液免疫功能，且有劑量依賴關(guān)系［8］。茯苓多糖在臨床上不僅是一種較好的免疫增強劑，而且能抗胸腺萎縮，減少脾臟增大，對免疫器官有很好的保護作用［9］。目前國內(nèi)外有關(guān)鼎湖鱗傘的研究報告很少。本文對鼎湖鱗傘多糖(polysaccharide from Pholiota dinghuensis Bi，PFPD)的免疫調(diào)節(jié)活性進行了研究，旨在為今后研發(fā)出新的天然藥物或保健品等方面，提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼎湖鱗傘粗多糖 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實驗室制備;雌性昆明種小白鼠 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(北京);小鼠用實驗動物飼料 江蘇協(xié)同生物工程有限公司;綿羊全血及豚鼠血清 上海川翔生物科技有限公司;無水乙醇、丙酮 均為分析純試劑;純凈水 購于蘇果超市;環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞制藥有限公司;溶菌酶(LZM) 南京建成生物工程研究所;二硝基氟苯 江蘇恒瑞制藥有限公司;鹽酸左旋米唑購于濟南奧德凱藥業(yè)有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基 上海生工生物工程有限公司。

HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司;HY－08高速粉碎機、DHG－9030A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;Heidolph Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph;AY－120電子精密天平、BL－220H分析天平 日本Shimadzu;Anke TDL－5低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;HYQ－2121A型旋渦混勻器 蘇州捷美電子有限公司;Synergy－2型酶標(biāo)儀 美國Biotek公司;0101型打孔機 寧波得力集團公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水提醇沉法制備粗多糖 取10g樣品粉末置于燒瓶內(nèi)，在90℃的熱水中，按照液料比20mL/g浸提6h，過濾后合并濾液，濃縮至原體積的1/5加入3倍體積的95%的乙醇純沉24h，以1000r/min的離心10min，分別以無水乙醇、丙酮沖洗2～3次，得到PFPD。

多糖得率(%)=鼎湖鱗傘多糖質(zhì)量/供試樣品質(zhì)量×100

1.2.2 PFPD提取的單因素實驗 提取溫度的影響:分別稱取5份1g鼎湖鱗傘菌絲體粉末，在浸提時間為 6h，液料比為 20mL/g，分別以 60、70、80、90、100℃五個溫度進行實驗，考察提取溫度對PFPD得率的影響。提取時間的影響:分別稱取5份1g鼎湖鱗傘菌絲體粉末，在浸提溫度為90℃，液料比20mL/g，以浸提時間為2、3、4、5、6h 五個時間梯度進行實驗，考察提取時間對PFPD得率的影響。提取液料比的影響:分別稱取5份1g鼎湖鱗傘菌絲體粉末，在浸提時間為6h，浸提溫度為 90℃，以液料比為 5、10、15、20、25mL/g五個梯度進行實驗，考察液料比對PFPD得率的影響。

1.2.3 鼎湖鱗傘多糖提取工藝正交實驗 選取浸提溫度(℃)、浸提時間(h)和液料比(mL/g)這三個因素進行三水平的正交實驗，因素水平表見表1。

表1 各因素水平設(shè)計Table 1 Design of every factor and level

1.2.4 動物分組及實驗設(shè)計 鼎湖鱗傘多糖體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性研究參照柯春林等［10－15］報道的方法作了一些修改。取同批次6周齡健康的雌性小白鼠，體重為(20±2)g進行適應(yīng)性飼養(yǎng)。飼養(yǎng)8d后，選擇體質(zhì)健壯、體重相近的小白鼠進行分組實驗。每組8只，共設(shè)置6組:第1組為正常對照組;第2組為模型對照組;第3組為陽性對照組;第4組為鼎湖鱗傘多糖低劑量組，標(biāo)記為PFPD－50;第5組為鼎湖鱗傘多糖中劑量組，標(biāo)記為PFPD－100;第6組為鼎湖鱗傘多糖高劑量組，標(biāo)記為 PFPD－200。正常對照組(Normal)每天腹腔注射一次生理鹽水0.5mL，共注射8d;環(huán)磷酰胺模型組(Cy－Model)每天腹腔注射一次生理鹽水 0.5mL，共注射 8d;實驗的第 2、3、4d，在每次注射完生理鹽水10h后，按劑量100mg/kg BW腹腔注射環(huán)磷酰胺一次;陽性對照組(Positive):每天腹腔注射一次鹽酸左旋米唑7mg/kg，共8d。鼎湖鱗傘多糖(PFPD)低劑量組每天一次腹腔注射多糖樣品劑量為50mg/kg BW;鼎湖鱗傘多糖(PFPD)中劑量組每天一次腹腔注射多糖樣品劑量為100mg/kg BW;鼎湖鱗傘多糖(PFPD)高劑量組每天注射劑量為200mg/kg BW的多糖樣品一次。實驗的第2、3、4d，在注射完多糖樣品10h后，按計量100mg/kg BW腹腔注射環(huán)磷酰胺一次。實驗連續(xù)進行8d，末次給藥12h后，將所有小鼠采用脫頸椎法全部處死，眼眶取血。解剖取出胸腺、脾臟，稱重并計算脾指數(shù)，胸腺指數(shù)，耳腫脹度，同時并測定血清溶血素及血清和脾臟中溶菌酶活性。小鼠飼養(yǎng)期間的環(huán)境溫度大約在24℃。實驗期間小鼠定量攝食(250g/kg BW左右)、自由飲水，鼠籠每天更換一次墊料。

1.2.5 鼎湖鱗傘多糖對免疫抑制小鼠器官的影響在末次給藥12h后，解剖小鼠取出脾臟、胸腺，用生理鹽水洗去血漬，濾紙吸干，稱重，計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(mg/g)=W1/W0

綜合以上分析，本文發(fā)現(xiàn)，中美英三方在實現(xiàn)不同的話語目的而采取了不同的趨近化語言策略，分別如圖1、圖2和圖3所示。

式中:W0為小鼠體重(g)，W1為臟器重量(mg)。

1.2.6 鼎湖鱗傘多糖樣品對小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響 注射給藥的第3d，給小鼠腹部剪去小塊毛發(fā)，面積約3cm×3cm，用1%二硝基氟苯(DNFB)50μL涂擦去毛部位。注射給藥的第7d，用1%二硝基氟苯20μL涂擦小鼠右耳兩側(cè)，左耳不擦作對照用。在末次給藥12h后，將小鼠脫頸椎處死后，用直徑為6mm的打孔器將左右耳片分別打孔，計算耳腫脹度。

耳腫脹度(%)=(W1－W0)/W0×100

式中:W0為左耳重量，W1為右耳重量。

1.2.7 鼎湖鱗傘多糖樣品對小鼠血清溶血素的影響(HC50) 在各組小鼠給藥的第4d，腹腔注射綿羊紅細胞0.2mL致敏。將制備好的血清稀釋至適宜倍數(shù)，各取0.2mL稀釋血清和2%的綿羊紅細胞0.1mL，再加入0.2mL配制好的豚鼠血清，混勻后放入37℃水浴30min。然后從每個樣品中吸取150μL加到酶標(biāo)板中，且每個樣品均做3個重復(fù)，用酶標(biāo)儀測540nm處的吸光度(OD540nm)值，記錄每個樣品的吸光度值，以O(shè)D值作為判定血清溶血素的指標(biāo)，比較各處理組小鼠的差異?？瞻讓φ?是用生理鹽水0.2mL代替血清樣品，其他操作同上。

1.2.8 鼎湖鱗傘多糖樣品對小鼠脾臟和血清中溶菌酶的影響 按上述方法，去脾臟，并且取出后將脾臟置于冰上，與生理鹽水按重量/體積比1∶9制備10%組織勻漿，5000r/min離心取上清液，放于－20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。斷頭處死小鼠后，解剖取出胸腺脾臟，同時稱重并計算臟器指數(shù)(mg/g BW)。用商業(yè)試劑盒測量(按其說明書操作)各組血清中溶菌酶(LZM)的含量。血清中LZM含量的測定是基于溶菌酶能夠水解細菌細胞壁上粘多糖而使細菌裂解、濃度降低、透光度增強的比濁法，表示為μg/mL。分組實驗連續(xù)飼養(yǎng)8d，最后一次用藥后便停食。24h后，稱重小鼠后斷頭處死，立即收集血液于小離心管中。血液樣品靜置1h，4000r/min離心10min制備小鼠血清。以上操作均在冰上進行，血清置－20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9 統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并應(yīng)用單因素方差分析和Duncan氏多重比較進行差異顯著性分析。p＜0.05被認為差異是顯著的。所有數(shù)據(jù)的分析比較都運用SPSS18.0版本進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼎湖鱗傘粗多糖提取條件的單因素實驗

2.1.1 提取溫度對多糖得率的影響 由圖1可知，當(dāng)提取溫度在60～90℃范圍內(nèi)，隨著熱水浸提溫度的升高，多糖含量呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，并且增加趨勢明顯。當(dāng)提取溫度為90～100℃時，多糖含量隨著溫度的升高，增加趨勢不明顯。由于浸提的溫度太高，多糖的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，所以確定提取的溫度為90℃。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharides

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響 從圖2中可以看出，在2～6h之間，隨著浸提時間的延長，多糖提取的含量逐漸增加。當(dāng)浸提的時間為6h時，提取的多糖含量最多，至6h后再延長提取時間，提取的多糖含量逐漸下降。因此，以提取的時間為6h為宜。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of time on extraction rate of polysaccharides

2.1.3 液料比對多糖得率的影響 由圖3可知，在液料比為5～20mL/g范圍內(nèi)，隨著液體比例的增加，提取的多糖含量隨之增加，但在20～25mL/g范圍內(nèi)，隨著液體比例的增加，提取的多糖含量有所減少，因此采用提取的液料比為20mL/g。

圖3 液料比對多糖得率的影響Fig.3 Effect of solvent－to－solid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.2 鼎湖鱗傘多糖提取條件正交實驗

以影響鼎湖鱗傘多糖得率的提取溫度(℃)、提取時間(h)和液料比(mL/g)這三個因素進行L9(33)正交實驗，考察這三個因素的協(xié)同作用下多糖的得率。其結(jié)果如表2。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experiment

由表2可知，對鼎湖鱗傘胞內(nèi)多糖得率的影響因素依次為RB＞RC＞RA，最優(yōu)化組合為 A2B3C2，即PFPD提取條件確定為液料比20mL/g、提取時間為6h、提取溫度90℃，此條件下多糖的得率為8.95%。通過水提醇沉法得到的粗多糖，主要成分為多糖類物質(zhì)還有蛋白質(zhì)及少量的小分子物質(zhì)［16］。

2.3 鼎湖鱗傘多糖對小鼠免疫器官臟器指數(shù)的調(diào)節(jié)作用

由于胸腺和脾臟是動物的重要免疫器官，因此胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的大小可以直接反映出機體免疫功能的強弱［17］。表3是鼎湖鱗傘多糖對小鼠免疫器官胸腺和脾臟的影響。

從表3中可以看出，PFPD－50為鼎湖鱗傘多糖低劑量組;PFPD－100為鼎湖鱗傘多糖中劑量組;PFPD－200為鼎湖鱗傘多糖高劑量組。模型組與正常對照組相比，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著減少。鼎湖鱗傘多糖(PFPD)在50mg/kg的劑量時，脾臟指數(shù)的數(shù)據(jù)顯示不顯著，但在多糖的劑量為200mg/kg時，脾臟指數(shù)的數(shù)據(jù)顯示有顯著性差異。由此可知免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)隨著PFPD濃度的增大而增大，甚至比正常小鼠的脾臟指數(shù)還大。以此說明鼎湖鱗傘多糖能使因環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)產(chǎn)生的脾臟指數(shù)下降得以恢復(fù)，在一定程度上起到了提高機體免疫的能力。但與環(huán)磷酰胺模型組相比，三種不同劑量的鼎湖鱗傘多糖均對環(huán)磷酰胺引起的小鼠胸腺指數(shù)下降無拮抗作用。

表3 PFPD對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響Table 3 Effect of PFPD on the index of spleen and thymus

2.4 鼎湖鱗傘多糖對遲發(fā)型超敏反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用［18］及對血清中溶血素(HC50)的影響［19－20］

鼎湖鱗傘多糖對小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)耳腫脹度的影響見表4中。

從表4中可以看出:環(huán)磷酰胺模型組和正常對照組相比，耳腫脹度顯著性減少(p＜0.05)。說明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。而陽性藥物組和不同劑量的鼎湖鱗傘多糖組處理，均顯著地提高DTH的耳腫脹度(p＜0.05)，且這種變化與鼎湖鱗傘多糖呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

鼎湖鱗傘多糖對小鼠血清中溶血素(HC50)的影響見表4所示:小鼠連續(xù)三天注射100mg/mL環(huán)磷酰胺后，其HC50值顯著降低(p＜0.05)。說明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。陽性藥物鹽酸左旋咪唑組與環(huán)磷酰胺免疫抑制模型相比，可以顯著地提高免疫小鼠體內(nèi)溶血素水平(p＜0.05)。當(dāng)PFPD濃度達到100mg/mL時，可以使小鼠血清中的溶血素水平提高，當(dāng)PFPD濃度為200mg/mL時，小鼠血清中溶血素水平大于正常小鼠水平。實驗結(jié)果表明:PFPD能有效提高免疫力低下小鼠的體內(nèi)免疫功能。

表4 PFPD對小鼠耳腫脹度和血清溶血素的影響Table 4 Effect of PFPD on swelling rate of ear

2.5 鼎湖鱗傘粗多糖對小鼠血清中溶菌酶活性的調(diào)節(jié)作用

從圖4中可以看出，環(huán)磷酰胺模型組與正常對照組相比，小鼠血清中的溶菌酶含量顯著降低(p＜0.05)，表明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。三種不同劑量的鼎湖鱗傘粗多糖組與正常對照組和模型組相比，其血清中的溶菌酶含量極顯著上升，且這種變化與劑量呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖4 PFPD對小鼠血清中溶菌酶活性的影響(U/mL)Fig.4 Effect of PFPD on activity of lysozyme in mice serum(U/mL)

2.6 鼎湖鱗傘粗多糖對小鼠脾臟中溶菌酶活性的調(diào)節(jié)作用

從圖5可知:與正常對照組相比，環(huán)磷酰胺模型組脾臟中溶菌酶含量顯著降低(p＜0.05)，表明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。小鼠腹腔注射不同劑量的鼎湖鱗傘多糖后，與正常對照組和模型組的小鼠相比，其脾臟中的溶菌酶含量極顯著上升，且這種變化與劑量組呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖5 PFPD對小鼠脾臟中溶菌酶活性的影響Fig.5 Effect of PFPD on activity of lysozyme in mice spleen(U/mL)

3 結(jié)論

本實驗表明:PFPD最佳的提取工藝條件為:提取溫度為90℃，提取時間為6h，液料比為20mL/g，PFPD的得率為8.95%。腹腔注射環(huán)磷酰胺后，免疫抑制鼠免疫功能和正常對照組相比有所下降，但用不同劑量的PFPD處理后免疫抑制鼠的免疫能力有所提高。環(huán)磷酰胺模型組與正常對照組相比，脾臟和血清中溶菌酶含量顯著降低(p＜0.05)，表明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。小鼠腹腔注射不同劑量的鼎湖鱗傘多糖后，與正常對照組和模型組的小鼠相比，其脾臟和血清中的溶菌酶含量均極顯著上升，且這種變化與劑量組呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。本實驗表明，PFPD具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性，能提高免疫抑制鼠的非特異性免疫反應(yīng)。由此得出鼎湖鱗傘粗多糖具有一定的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性，是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑。

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