朱玉霞，李 恒，陳列歡，許正宏，史勁松，*

(1.江南大學藥學院，江蘇無錫214122;2.淮海工學院海洋學院，江蘇連云港222005)

殼寡糖(Chitooligosaccharides，COS)是殼聚糖主鏈斷裂后的降解物，在增強免疫、抗腫瘤抗癌、防腐抑菌、降低膽固醇、加速體內(nèi)鈣和鐵的吸收以及關節(jié)組織的修復等方面都具有廣泛應用前景［1］。殼寡糖的功能研究和應用開發(fā)已持續(xù)進行了近20年，其生物活性與聚合度(Degree Polymerization，DP)的關系一直是研究的熱點。基礎研究領域越來越傾向于針對寡糖的單組分進行多方面的功能評價，并為滿足特定的生物學功能，對寡糖分子進行結構修飾或組方復配，而在應用研發(fā)領域，較多地采用組分分離工藝，實現(xiàn)特定組分的富集并用于功能產(chǎn)品的制備。近年來發(fā)現(xiàn)，低聚合度的殼寡糖在改善骨關節(jié)炎的癥狀，促進關節(jié)軟骨的代謝活動方面功能突出，并具有較強的抑制腫瘤細胞生長和護肝功能［2－5］。與此同時，糖工程技術的進步為寡糖組分分離與分析技術的發(fā)展奠定了良好的基礎，并推動了殼寡糖構效關系的研究。繼薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)之后，質(zhì)譜法(MS)、凝膠電泳法以及熒光輔助毛細管電泳法等［6－7］相繼被應用于寡糖分析，使寡糖組分的精細辨別成為可能。但對于分子中含有修飾基團的組分，如含有N－乙?；膸锥」烟恰⒑蠴－羧甲基或N－羧甲基的殼寡糖，上述方法在進行定性和定量檢測時仍存在一定困難，對含有修飾基團組分的殼寡糖的分析，一般需要多種方法聯(lián)合進行，在缺乏標準品的情況下，還需要借助質(zhì)譜、光譜學等手段。超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(UPLC－MS)是目前最為先進的用于復雜體系分離分析以及化合物結構鑒定的色譜質(zhì)譜整合平臺［8］，具有更高的分離度、更快的分析速度和更高的靈敏度，已廣泛應用于食品添加劑、污染物殘留、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等的快速檢測。本研究采用酶法降解殼聚糖和乙醇分級沉淀法獲得了低聚合度殼寡糖，并利用 HPLC和UPLC－MS對其組分進行分析，初步探索了寡糖組分的色譜行為，發(fā)現(xiàn)寡糖在柱上的分離與分子中所含的極性基團(氨基和羥基)有直接的關系，并根據(jù)極性基團和Rf值作出相關方程，旨在為殼寡糖組分的結構分析和功能研究提供先進、可靠手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 脫乙酰度85%，國藥集團化學試劑公司;殼聚糖酶 浙江金殼生物化學有限公司;殼寡糖標品 由淮海工學院制備并提供;乙腈 色譜純;其他化學試劑皆為分析純;實驗用水為超純水，臨用前經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。

Agilent1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Alltech ELSD 3300檢測器 美國Grace公司;Waters Acquity超高效液相色譜儀，SYNAPT QTOF MS(配有電噴霧電離源，ESI)質(zhì)譜儀 美國沃特世(Waters)公司;UV1700紫外可見分光光度計 上海鳳凰科學儀器有限公司;GL－208型高速冷凍離心機日立集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼寡糖的酶法制備 將3g殼聚糖加入到100mL 2% 醋酸溶液中，攪拌使其成分溶解，調(diào)溶液pH為5.8，殼聚糖酶用量為10U/g底物，45℃恒溫水浴酶解6h。酶解結束后調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，離心(8000r/min，10 min)去除沉淀，上清液濃縮至10mL體積，分別加入無水乙醇 10、30、40、90、190mL，于4℃冰箱靜置8h后，離心去除沉淀，上清液真空濃縮脫除乙醇后，經(jīng)冷凍干燥得到殼寡糖樣品。

1.2.2 殼寡糖數(shù)均分子量的測定 利用乙酰丙酮法測定殼寡糖數(shù)均分子量［9］。

1.2.3 TLC分析條件 配制濃度為10mg/mL的殼寡糖樣品，取2μL于高效硅膠板上進行點樣，置于預飽和好的層析缸中，以上行法展開。展開劑為乙酸乙酯/甲醇/水/氨水=5/9/1/1.5(體積比)。顯色劑采用0.3% 茚三酮正丁醇溶液，105℃顯色。

1.2.4 HPLC分析條件 采用Shodex NH2P－50 4E色譜柱(5μm，250mm ×4.6mm)，流動相為乙腈－3‰的氨水(pH10)，0～5min:70%乙腈，5～60min:70%乙腈－50%乙腈梯度洗脫，樣品濃度1mg/mL，流速1.0mL/min，柱溫 30℃，進樣體積 10μL，蒸發(fā)光散射檢測器。

1.2.5 UPLC/MS分析條件 采用BEH Amide色譜柱(1.7μm，2.1mm ×100mm)，流動相為乙腈－水，0～15min:80%乙腈－20%乙腈梯度洗脫，樣品濃度1mg/mL，流速 0.3mL/min，柱溫為45℃，進樣量1μL。

質(zhì)譜分析采用電噴霧離子源(ESI+)，質(zhì)譜參數(shù)設定如下:離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度300℃，毛細管電壓3.5kV，錐脫溶劑氣流量500L/h，錐孔電壓:30V，錐孔氣流量:50L/h，四級桿范圍 m/z:100～1200，碰撞能量6V。

2 結果與分析

2.1 低聚合度殼寡糖樣品的制備

為獲得低分子量殼寡糖，一是要保證足夠的加酶量，二是要有足夠長的酶解時間。在本實驗條件下，酶解6h后，水解液中的還原糖含量不再上升。水解結束后，通過pH調(diào)節(jié)至弱堿性，使尚未水解的大分子殼聚糖沉淀，然后再通過乙醇沉淀法對較大分子的殼寡糖進行沉淀。實驗研究了不同濃度的乙醇對殼寡糖的沉淀情況，TLC圖譜顯示(圖1)，乙醇濃度＜90%時，6糖以上組分在原點沒有展開，而6糖以下組分含量相對較低，乙醇濃度＞90%時，沉淀效果基本無差別，從經(jīng)濟方面考慮，選用90%乙醇沉淀酶解后的殼寡糖。乙醇沉淀后的溶液中主要以氨基葡萄糖－殼六糖為主，采用乙酰丙酮法測定的數(shù)均分子量為680，聚合度為3.7。而乙醇濃度低于90%，對六糖以上的組分沉淀不完全。盡管乙醇沉淀法不能精確地對各個組分進行分離，但可以作為一種制備低聚合度殼寡糖的極為有效的方法。

圖1 不同濃度乙醇沉淀后的TLC圖譜Fig.1 TLC chromatogram of the different concentrations of ethanol precipitation

2.2 HPLC對殼寡糖組分的分析

實驗采用TLC的展開條件已能夠較為清晰地顯示出殼寡糖的組成，通過氨基葡萄糖、殼二糖、殼三糖等標準品，可以定性確定組分中含有單糖到六糖成分，但用于定量研究，TLC具有一定的局限性。盡管可以通過斑點的灰度積分獲得組分的相對含量，但這種方法操作繁瑣，并受多種因素影響。

利用Shodex的聚乙烯醇氨基柱(NH2P－50 4E)進行殼寡糖的HPLC分析，可以獲得分離度較好的譜圖。該色譜柱與硅膠氨基柱相比，在同樣的流動相條件下，對糖類化合物的分離性能更高，再現(xiàn)性更好。對本實驗的低聚合度殼寡糖進行分析，采用梯度洗脫，獲得6個色譜峰，根據(jù)標準品的保留時間，可以確定圖譜中1～6依次為氨基葡萄糖、殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖。其中殼三糖、殼四糖具有較高的塔板數(shù)。

由于殼寡糖存在基團修飾問題，最常見的是氨基的乙?；?。如果殼聚糖的脫乙酰不完全，就可能形成帶有N－乙?；臍す烟?，使寡糖的色譜行為受到影響，從而產(chǎn)生色譜峰變寬現(xiàn)象，這在本實驗殼寡糖樣品分析中也得到體現(xiàn)，與標準品色譜峰相比，圖2中的寡糖樣品峰顯然變寬，表明這些色譜峰組分還含有一定量的N－乙?；瘹す烟?。氨基柱屬正向分離柱，寡糖在柱上的分離主要與分子中所含的極性基團相關，而在殼寡糖分子中，除了羥基外，還含有氨基，而且氨基的極性要大于羥基。單組分殼寡糖的分離情況實際上與分子中所含的羥基數(shù)目和氨基數(shù)目直接相關。對標樣組分的Rf與分子中極性基團數(shù)(x)進行相關性作圖，則Rf(x)=0.8038x+2.019，R2=0.9808。當殼寡糖分子中氨基被乙酰化后，其有效極性基團數(shù)目減少，就會導致Rf值變化，尤其是同時存在兩個或三個乙酰基團時，就可能與低一個聚合度的組分混淆。因此，在圖2的譜圖中，單一的色譜峰也極大可能還含有乙?；臍す烟?，甚至是聚合度不同的組分。

表1 殼寡糖標準品HPLC保留時間Table 1 The Retention time of COS standard

圖2 殼寡糖組分的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of the COS

2.3 殼寡糖組分的UPLC－MS分析結果

采用UPLC－MS可以對色譜峰中的組分進行定性鑒定。在殼寡糖樣品的液質(zhì)聯(lián)用圖譜中(圖3)，也可以獲得6個顯著的色譜峰。

在三乙?；鶜に奶侵校瑯O性基團數(shù)是11，而殼三糖的極性基團數(shù)也為11，這兩種物質(zhì)的色譜峰并沒有得到良好分離。由于氨基的極性大于羥基，三乙?；鶜に奶侵泻?個氨基，殼三糖中含有三個氨基，因而在出峰順序上，三乙?；鶜に奶且栽缬跉と?。與這種情況相似的還有二乙酰基殼三糖也早于殼二糖，盡管后者極性基團數(shù)目還要少一個。

圖3 殼寡糖的UPLC/MS圖譜Fig.3 UPLC/MS/MS chromatogram of the COS

3 結論與討論

采用酶法進行殼寡糖制備，由于殼聚糖酶具有一定的底物專一性，其糖基的乙?；潭扔绊懡到庑?，并影響產(chǎn)物的平均聚合度。為獲得較低聚合度的殼寡糖，需要選擇高脫乙酰度的殼聚糖。理論上完全脫除乙?；臍ぞ厶强梢垣@得不含乙?；臍す烟?，其酶解產(chǎn)物也是完全意義上的殼寡糖，而含有乙?；鶊F的殼寡糖為雜合殼寡糖，全部氨基上都含有乙?；鶊F的殼寡糖又稱幾丁寡糖。高脫乙酰度殼聚糖價格較高，實際生產(chǎn)上用于制備殼寡糖的殼聚糖大都含有乙酰基，因而水解獲得的寡糖中含有乙酰殼寡糖，同時由于乙?；鶊F的存在，使殼聚糖酶的水解位點減少，導致高聚合度產(chǎn)物的增加，并且這些組分并不能通過增加水解時間或增加酶量予以大幅度降低。要獲得低聚合度寡糖組分，還需要采用分離工藝，如本實驗使用的有機溶劑沉淀分級法，此外還有層析法、膜分離法等。沉淀法是一種操作簡單、重復性好、經(jīng)濟可行的工藝，但該法不能對DP＜6的組分進行分離，進一步的組分分離操作常采用柱層析方式，在單體的量化制備方面，目前仍缺乏有效的、系統(tǒng)化的解決方案。

對殼寡糖組分色譜行為的探討也有助于寡糖組分的分離工作，高效液相色譜柱的分離原理與制備色譜柱的原理一致，同樣，寡糖組分的N－乙?；梢詫е鹿烟遣话凑站酆隙鹊拇笮∵M行色譜分離，如本實驗中三乙?；鶜に奶浅龇鍟r間要略早于殼三糖，二乙?；鶜と浅龇鍟r間也略早于殼二糖，因此在進行柱層析制備殼寡糖單體時，需要考慮基團乙酰化的影響，如利用高脫乙酰的殼聚糖為原料，避免形成乙酰殼寡糖;或者對殼寡糖進行乙?；揎?，消除氨基的影響，在組分分離后再進行乙酰基團脫除。

［1］Xia WSh，Liu P，Zhang JL，et al.Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides［J］.Food Hydrocolloids，2011，25(2):170－179.

［2］Nagaoka I，Igarashi M，Sakamoto K.Chapter 22－Biological Activities of Glucosamine and Its Related Substances［J］.Advances in Food and Nutrition Research，2012，65:337－352.

［3］袁建平，李國輝，王淑敏，等.聚合度4－6殼寡糖的制備及其活性研究［J］.食品科技，2012，37(8):248－250.

［4］Kenji S，Akihiro T，Yasuhide O，et al.Effect of N－acetylchito－ oligosaccharides on activation of phagocytes［J］.Microbiol Immunol，1986，30(8):777.

［5］Kenji S，Tadahisa M，Yasuhide O，et al.Antitumor effect of N－acetylchitohexaose and chitohexaose［J］.Carbohydr Res，1986，151:403－408.

［6］Pricea NPJ，Annika T.Naumann A high－throughput matrixassisted laser desorption/ionization－time－of－flight mass spectrometry－ based assay of chitinase activity［J］.Analytical Biochemistry，2010，411(2011):94－99.

［7］杜昱光.殼寡糖的功能研究及應用［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2009:50－51.

［8］黃昆，李寶才，王文輝，等.UPLC－MS技術在食品安全分析檢測方面的應用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(8):105－109.

［9］韓寶芹，位曉娟，房子，等.乙酰丙酮法測定甲殼胺寡糖數(shù)均分子量［J］.中國海洋藥物雜志，2004，23(6):12－17.