崔 瀟，江虹銳，*，劉小玲，林 瑩，肖碧紅，白 洋

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530000;2.百洋水產(chǎn)集團(tuán)有限公司，廣西南寧530000;3.廣東百維生物科技有限公司，廣東化州525100)

羅非魚又稱非洲鯽魚，屬鱸形目、麗魚科，是我國主要的淡水經(jīng)濟(jì)魚種。目前我國羅非魚出口呈逐年上升趨勢，產(chǎn)品主要是凍魚片和凍全魚兩大類，在加工過程中產(chǎn)生的魚皮、魚骨、魚頭等下腳料高達(dá)原料的60%以上，不僅形成極大的浪費還造成了環(huán)境污染［1］。因此，充分利用羅非魚下腳料資源，采用現(xiàn)代生物技術(shù)方法對羅非魚下腳料資源進(jìn)行再加工，提高其經(jīng)濟(jì)價值勢在必行。近年來，人們開始關(guān)注從水產(chǎn)類下腳料中獲得的膠原肽的活性以及與金屬螯合的研究。如霍健聰?shù)妊芯苛藥~下腳料制備多肽鐵螯合物［2］。張俊敏等研究了鱈魚皮膠原蛋白鋅肽螯合物的制備［3］。陸劍鋒等研究了斑點叉尾回魚魚骨膠原蛋白螯合鈣的制備［4］。許慶陵等研究了羅非魚魚肉與鋅的螯合條件［5］。但是，關(guān)于鎂(Mg)與膠原肽的螯合工藝研究未見報道。鎂(Mg)是人體內(nèi)能量代謝和許多酶促反應(yīng)的激活劑，低Mg可使機體細(xì)胞溶血脆性升高導(dǎo)致人體新陳代謝紊亂［6］，包括血壓升高、胰島素分泌障礙、血脂代謝障礙及引發(fā)相關(guān)的代謝綜合癥。攝入充足的Mg制劑可以對這些代謝紊亂癥起到預(yù)防和改善的作用［7］。探討鎂離子與膠原多肽螯合反應(yīng)最佳工藝條件，旨在為羅非魚下腳料的深加工提供新途徑，同時為鎂補充劑提供一種新的來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚魚皮膠原多肽 廣西百洋水產(chǎn)集團(tuán)股份有限公司提供，分子量≤3000u;氯化鎂(MgCl2)，分析純 成都市科隆化學(xué)試劑廠;EDTA二鈉鹽，分析純 西隴化工股份有限公司;絡(luò)黑T，分析純 天津科密歐試劑有限公司。

pH5J－3F實驗室pH計 上海佑科儀器儀表有限公司;GSY－Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療設(shè)備廠;臺式低速自動離心機 長沙平凡儀器公司;FA電子分析天平 上海精科儀器;傅里葉變換紅外光譜儀(FTID Spectrometer) 天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 螯合反應(yīng)工藝流程 魚皮膠原多肽→溫水溶解(60℃)→加入MgCl2→調(diào)節(jié)溫度→調(diào)節(jié)pH→鰲合反應(yīng)→加入乙醇洗滌→離心(5000r/min)→取沉淀→純化→烘干→多肽鎂鰲合物。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化魚皮膠原多肽鎂離子螯合反應(yīng)的工藝條件 膠原多肽與鎂離子螯合反應(yīng)過程中，以螯合率為評價指標(biāo)，以膠原蛋白多肽與MgCl2的質(zhì)量比(實驗時固定膠原蛋白多肽的質(zhì)量為恒量，改變鎂離子的質(zhì)量)、反應(yīng)體系的pH、溫度和時間為影響因素設(shè)計螯合反應(yīng)單因素實驗，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，質(zhì)量比、pH、溫度對螯合體系反應(yīng)的影響較大，而當(dāng)反應(yīng)時間大于30min對螯合體系無影響。因此，設(shè)計以螯合率為響應(yīng)值，以膠原蛋白肽:MgCl2的質(zhì)量比、pH、反應(yīng)溫度為影響因素的三因素三水平17個試驗點的響應(yīng)面分析實驗，因素水平編碼見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 螯合率的測定 采用EDTA絡(luò)合法對膠原蛋白肽Mg螯合反應(yīng)進(jìn)行評價［8］。

螯合率(%)=螯合態(tài)Mg的含量/Mg的總量×100=CV1/CV0×100

式中:C為 EDTA二鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1為滴定螯合態(tài)Mg的含量所消耗的EDTA二鈉鹽溶液體積，mL;V0為滴定Mg的總量所消耗的EDTA二鈉鹽溶液體積，mL。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 取已經(jīng)制備好的羅非魚魚皮膠原多肽鎂的螯合物約2mg放入瑪瑙研缽中，與200mg左右干燥的光譜純級KBr混合并研磨均勻。將研磨后的混合物制成壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀，采用漫光反射模式測定在4000～400cm－1區(qū)間吸收光譜，分析特征峰。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有實驗均進(jìn)行3次平行實驗，利用Design Expert8.05b軟件對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)分析處理，探究影響相應(yīng)值的最關(guān)鍵因素，并找出制備羅非魚魚皮膠原多肽鎂螯合物的最優(yōu)條件。p＜0.05為差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗對羅非魚魚皮多肽鎂螯合率的影響

2.1.1 質(zhì)量比對螯合率的影響 固定膠原多肽與Mg離子螯合反應(yīng)過程中體系溫度為70℃，pH7.0，反應(yīng)時間30min，以膠原多肽:MgCl2的質(zhì)量比為變量探究質(zhì)量比對多肽鎂螯合率的影響，結(jié)果如圖1所示。螯合率隨著質(zhì)量比的增加而增大，當(dāng)質(zhì)量比為1∶5時螯合率達(dá)到最大值，當(dāng)繼續(xù)增大質(zhì)量比螯合率開始下降。螯合反應(yīng)體系的質(zhì)量比是影響多肽與金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)的一個重要因素，質(zhì)量比太小時，膠原多肽與Mg離子很難形成環(huán)狀穩(wěn)定配合物［9］，質(zhì)量比過大，螯合反應(yīng)后剩余的膠原多肽增多，造成了原料的浪費。因此，膠原多肽:MgCl2的質(zhì)量比設(shè)定為1∶5。

圖1 質(zhì)量比對螯合率的影響Fig.1 Effect of Collagen Petide/Mg2+weight ratio on ability of chelation

2.1.2 pH對螯合率的影響 固定膠原多肽與Mg離子螯合反應(yīng)過程中體系溫度為70℃，質(zhì)量比為1∶5，時間30min，改變體系pH，探究不同pH對螯合率的影響，結(jié)果如圖2所示。pH對螯合率的影響很大，隨著pH的升高螯合率逐漸增大，當(dāng)pH7.0時螯合率達(dá)到最大值，繼續(xù)增大pH螯合率明顯下降。pH過小時，體系中含有大量H+，H+會與Mg2+爭奪供電基團(tuán)，不利于螯合物的形成，當(dāng)pH過大時，鎂離子形成氫氧化物沉淀，也會影響螯合物的形成［10］。因此，膠原多肽與Mg離子螯合反應(yīng)，體系pH7.0時為宜。

圖2 pH對螯合率的影響Fig.2 Effect of pH on ability of chelation

2.1.3 溫度對螯合率的影響 固定膠原多肽與Mg離子螯合反應(yīng)過程中體系質(zhì)量比為1∶5，pH7.0，時間30min，探究不同溫度對螯合率的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著溫度的升高，螯合率明顯增加，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時，螯合率達(dá)到最大值，再升高溫度，螯合率開始快速下降。這是由于螯合反應(yīng)是一個放熱反應(yīng)，溫度過高不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行［4］。因此，膠原多肽與Mg離子螯合反應(yīng)，體系溫度控制在70℃時為宜。

圖3 溫度對螯合率的影響Fig.3 Effect of temperature on ability of chelation

2.1.4 時間對螯合率的影響 固定膠原多肽與Mg離子螯合反應(yīng)過程中體系質(zhì)量比為1∶5，pH7.0，溫度70℃。以反應(yīng)時間為變量，探究時間對螯合率的影響，結(jié)果如圖4所示。在30min內(nèi)，螯合率隨時間的延長逐漸上升，當(dāng)T=30min時，螯合率達(dá)到最大值，繼續(xù)延長反應(yīng)時間對螯合率影響不大。一般的金屬離子配位反應(yīng)是室溫下的快速反應(yīng)。大多數(shù)的金屬離子在溶液中可以發(fā)生快速反應(yīng)，其半衰期僅為毫秒到微妙之間［11］。因此，實驗將膠原多肽與鎂離子螯合反應(yīng)時間設(shè)定為30min。

圖4 時間對螯合率的影響Fig.4 Effect of time on ability of chelation

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應(yīng)面分析方案與實驗結(jié)果 根據(jù)表1因素水平編碼表選擇質(zhì)量比、pH、溫度為自變量，分別記為X1、X2、X3，并以螯合率為響應(yīng)值Y，設(shè)計響應(yīng)面實驗，實驗方案及結(jié)果見表2。實驗結(jié)果經(jīng)過Design Expert8.05b軟件處理，得到響應(yīng)面二次回歸方程:Y=84.48+1.46X1－0.49X2+0.88X3－1.60X1X2+0.36X1X3+3.96X2X3－6.96X12－3.23X22－5.92X32。

表2 響應(yīng)面實驗方案及實驗結(jié)果表Table 2 The response surface experiment schemes and experiment results

響應(yīng)面實驗中，質(zhì)量比、溫度、pH對膠原肽與Mg離子螯合反應(yīng)影響的方差分析，見表3。表中直觀的反映出這三個因素對螯合率影響的顯著性，依次為質(zhì)量比＞溫度＞pH。質(zhì)量比和溫度直接影響螯合率的大小，而pH對螯合率的影響相對較小。響應(yīng)面實驗中復(fù)合相關(guān)系數(shù)R2=0.94640，R2adj=0.91430說明該模型與實驗擬合程度好;在p＜0.05為差異性顯著的條件下，失擬項不顯著;回歸方程顯著。建立的回歸方程模型符合實際情況，回歸方程有效。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 The results of Regression model of variance analysis

2.2.3 響應(yīng)曲面圖型分析與優(yōu)化 魚皮膠原多肽與鎂離子的響應(yīng)曲面圖見圖5～圖7。圖5～圖7非常直觀的反映出各個因素對響應(yīng)值的影響，曲面圖形的形狀可以反映出影響因素的顯著性。圖形的形狀近似圓形說明各個因素之間的交互作用不很顯著。經(jīng)過Design Expert8.05b對數(shù)據(jù)處理得出的最優(yōu)條件是:質(zhì)量比為 1∶5.12，pH6.93，溫度為 70.53℃，響應(yīng)面模型預(yù)測的螯合率為84.315%。

根據(jù)實驗室的實際情況及方案實施的可操作性將最優(yōu)方案工藝參數(shù)修正為質(zhì)量比為1∶5，pH為7.0，溫度為70℃，以此條件進(jìn)行三次平行試驗測得的螯合率為84.580%，與預(yù)測值相比誤差為0.265%。因而，說明通過響應(yīng)曲面法預(yù)測得到的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠具有實用價值。在相關(guān)研究中，羅非魚下腳料蛋白多肽在最優(yōu)條件下與鋅的螯合率為87.56%［12］。帶魚蛋白水解液在最適條件下與亞鐵離子的螯合率為93.000%［13］。因此，本實驗所得的螯合工藝條件比較合理。

圖5 質(zhì)量比和pH對魚皮膠原蛋白多肽鎂螯合物的響應(yīng)面圖Fig.5 Quality ratio and pH on the response surface of fish skin collagen peptides chelating magnesium

圖6 質(zhì)量比和溫度對魚皮膠原蛋白多肽鎂螯合物的響應(yīng)面圖Fig.6 Quality ratio and temperature on the response surface of fish skin collagen peptides chelating magnesium

圖7 溫度和pH對魚皮膠原蛋白多肽鎂螯合物的響應(yīng)面圖Fig.7 Temperature and pH of the response surface of fish skin collagen peptides chelating magnesium figure

2.3 魚皮膠原多肽及魚皮膠原多肽鎂螯合物的紅外光譜分析研究

膠原蛋白溶液中存在氨基酸殘基之間的酰胺鍵，還有少量的氨基和羧基。通過紅外光譜分析，膠原多肽的圖譜中會出現(xiàn)氨基(－NH2)和羧基(C=O)的吸收峰，膠原多肽與鎂離子螯合后，使吸收峰發(fā)生改變或者偏移［14］。

膠原蛋白與膠原蛋白螯合鎂的紅外光譜如圖8(a，b)所示，圖8a為魚皮膠原多肽的紅外光譜圖，8b為魚皮膠原多肽鎂螯合物的紅外光譜圖。圖8a中3411.51cm－1是－NH2的吸收峰，是由N－H的伸縮振動引起;1646.94cm－1屬于酰胺Ⅰ帶，是由C=O的伸縮振動引起［15］;1162.89cm－1是NH3+的變角振動吸收峰。622.89cm－1處則是由N－H面外變形振動引起［16］。圖8b加入Mg離子后，3411.51cm－1氨基的伸縮振動吸收峰出現(xiàn)偏移，向高波位移動，且吸收峰變?nèi)酰?22.89cm－1處吸收峰向高波數(shù)移動，吸收峰變?nèi)?，表明Mg2+與氨基有結(jié)合［17］。酰胺Ⅰ帶吸收峰1646.94－1cm－1向高波移動且鰲合前后出現(xiàn)強弱變化，推測羧基可能也以共價建的方式與鎂離子結(jié)合。1162.89cm－1處的NH2吸收峰向低波位發(fā)生了偏移，且吸收峰變?nèi)?，推測Mg2+與－NH2之間存在的結(jié)合用。

圖8 膠原多肽和膠原多肽螯合鎂的FT－IR光譜圖Fig.8 FT－IR spectrogram of collagen and petide chelate magnesium

3 結(jié)論

本實驗在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面優(yōu)化實驗的方法，確定了羅非魚魚皮膠原蛋白多肽螯合鎂的最佳工藝條件為:質(zhì)量比1∶5、溫度70℃、pH7.0、時間30min，螯合率達(dá)到84.580%。其中各因素對螯合率影響大小的順序是質(zhì)量比＞溫度＞pH。并且通過紅外光譜實驗證明了膠原多肽鎂螯合物的存在。

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