胡青平，張 紅，周 冰，張亞軍，李貴琴，田呈瑞

(1.陜西師范大學(xué)食品工程學(xué)院，陜西西安710062;2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004)

光合細菌(Photosynthetic bacteria，簡稱PSB)是自然界中能以光合作用產(chǎn)能的細菌，是地球上最早出現(xiàn)的具有原始光能合成體的原核生物［1］。它具有固氮、固碳、脫氫、硫化物氧化等不同的生理生化功能，并在自然界的氮、碳、硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。因此，具有重要的科學(xué)研究價值［2－3］。光合細菌分布廣泛［4－6］，可直接處理高濃度有機廢水，不存在污泥處理問題;可綜合利用作餌料和肥料，所需場地少費用低。還在減防魚病、培養(yǎng)有益藻類和豐富飼料添加劑等方面具有巨大的應(yīng)用價值［7］。所以已在許多科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)引起了人們的高度重視。目前，對光合細菌生長條件優(yōu)化的研究有很多［8－10］，主要有溫度、pH、光照、培養(yǎng)基成分等，但溫度、pH、培養(yǎng)基鹽含量對光合細菌的影響及其相互作用的研究卻很少見，這些條件與光合細菌的生長繁殖也起著至關(guān)重要的作用，具有很重要的現(xiàn)實意義。本研究從山西臨汾汾河大橋下的表層污泥中分離得到光合細菌PSB－B，該光合細菌對檸檬酸類廢水有較好的降解作用(數(shù)據(jù)未給出)且前期實驗還發(fā)現(xiàn)，鹽濃度對PSB－B菌的生長影響很大，因此，優(yōu)化PSB－B菌的生長條件為其進一步的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

光合細菌PSB－B 分離于山西臨汾汾河大橋下的表層污泥，純化后分別保存于固體和液體培養(yǎng)基中，液體菌菌液顏色為深紅色并有紅色沉淀，菌種活力良好;酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基［7，9－10］:酵母膏 3g，蛋白 胨 3g，CaCl23g，MgSO4·7H2O 3g，蒸 餾 水1000mL，pH6.8;酵母膏蛋白胨固體培養(yǎng)基添加瓊脂20g，在鹽濃度的實驗中，添加一定濃度的NaCl。

BSG－300光照培養(yǎng)箱、YXQ－LS－SII全自動立式電壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長條件研究

1.2.1.1 單因素實驗 在250mL的液體培養(yǎng)基中接種光合細菌PSB－B的菌液10mL，分別在pH為7、鹽濃度為0單位的條件下，設(shè)置溫度為22、24、26、28、30、32℃來分析其最適溫度;在溫度為28℃、鹽濃度為0單位的條件下，設(shè)置 pH 為 5、6、7、8、9 來分析其最適pH;在pH為7，溫度為28℃的條件下，設(shè)置培養(yǎng)基鹽濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/100mL 來分析其最適鹽濃度。

1.2.1.2 響應(yīng)曲面實驗設(shè)計［11－14］根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇溫度、pH和鹽濃度3個因素作為響應(yīng)變量，利用Design－Expert軟件按照旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計原理，以PSB－B菌在600nm下的吸光度為響應(yīng)值(OD)，通過響應(yīng)面曲面分析進行生長條件的優(yōu)化，得到最優(yōu)生長條件。各實驗組的編碼與取值見表1。共20個實驗點，其中14個為析因點，6個為零點。零點實驗進行6次，做誤差估計。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.2 光合細菌生長量測定 以上實驗均接種于300mL的錐形瓶中，用封口膜封口，置于光照強度為3679.7～4987.0Lux的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，每天定時搖晃一次，用可見光分光光度計在600nm處測量光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

分別研究了溫度、pH和鹽濃度三個因素對PSB－B菌生長的影響，結(jié)果見圖1～圖3。

從圖1中可知，PSB－B菌在接種后生長迅速，隨時間延長，光密度值增加，但溫度為28℃時，光密度值增加最快，生長態(tài)勢最好，第5d達到最高光密度1.319，溫度過低或過高都會對PSB－B菌生長產(chǎn)生不利影響，溫度過低菌體生長緩慢，溫度過高菌體生長受到抑制。因此，最適溫度為28℃。從圖2中可知，PSB－B菌在pH7時光密度值最高，第5d達到最高光密度1.287。pH6和pH8時光密度值略低于pH7時的光密度值。但pH5、pH9時光密度值明顯低于pH7時的光密度值，因此，pH過低或過高都會嚴重影響PSB－B菌生長狀況。所以最適pH7。從圖3中可知，培養(yǎng)基鹽濃度為0.1～0.3g/100mL時光密度值增加，鹽濃度超過0.3g/100mL后PSB－B菌的生長受到抑制，光密度值迅速降低。因此，最適鹽濃度為0.3g/100mL。由此可知，三因素對PSB－B菌的生長都有一定的影響，最佳的單因素實驗結(jié)果分別為:溫度28℃，pH7，鹽濃度0.3g/100mL。

圖1 不同溫度下PSB－B菌的生長情況Fig.1 The growth of bacteria PSB－B at different temperatures

圖2 不同pH下PSB－B菌的生長情況Fig.2 The growth of bacteria PSB－B at different pH

圖3 不同鹽濃度下PSB－B菌的生長情況Fig.3 The growth of bacteria PSB－B at different NaCl concentrations

2.2 響應(yīng)曲面分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計實驗結(jié)果分析 運用Design－Expert數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件，得到實驗方案與結(jié)果，如表2。通過對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，得回歸模型:

OD=－44.93+2.305A+3.985B+4.470C－0.02163AB－0.1994AC+0.3925BC－0.03774A2－0.2559B2－3.163C2。對該模型進行回歸分析，方差分析結(jié)果見表3。

表2 旋轉(zhuǎn)中心組合實驗設(shè)計方案和結(jié)果Table 2 Design and results ofcentral composite rotatable experiment

表3可知，該模型的p＜0.0001，表明該模型在95%水平上顯著。其失擬值為0.8836＞0.05，不顯著，模型較準確。說明該模型擬合程度良好，實驗誤差小，可以用此模型來分析和預(yù)測結(jié)果。模型中一次項A、B顯著，二次項 A2、B2高度顯著，C2顯著，而交互項AC顯著。表明對于光合細菌生長量，溫度和pH表現(xiàn)出顯著的線性影響，溫度和NaCl則表現(xiàn)出顯著的耦合影響。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸方程，采用Design Expert軟件對該模型繪制響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，圖4～圖6所示為回歸方程預(yù)測的三個因素耦合影響下的響應(yīng)面三維圖及相應(yīng)等高線圖。

圖4表明，溫度和pH對PSB－B菌生長影響呈拋物線型關(guān)系，且均有一個極大值點。在當前實驗范圍內(nèi)，當溫度不變，隨著pH的升高，OD值先升高后降低，當pH不變，隨著溫度的升高，OD值先升高后降低。OD值變化速率顯示，溫度的主效應(yīng)略強于pH效應(yīng)，等高線接近圓形，說明溫度和pH的交互作用不顯著。

圖4 溫度和pH對PSB－B菌生長影響Fig.4 Response surface for the effect of temperature and pH on the growth of bacteria PSB－B

圖5表明，溫度和鹽濃度對PSB－B菌生長影響呈拋物線型關(guān)系，且均有一個極大值點。在當前實驗范圍內(nèi)，當溫度不變，隨著鹽濃度的升高，OD值降低，當鹽濃度不變，隨著溫度的升高，OD值先升高后降低。OD值變化速率顯示，溫度對PSB－B菌生長影響大于鹽濃度的影響，等高線呈橢圓型，說明兩個因素之間交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 溫度和NaCl對PSB－B菌生長影響Fig.5 Response surface for the effect of temperature and NaCl on the growth of bacteria PSB－B

圖6表明，pH和鹽濃度對PSB－B菌生長影響呈拋物線型關(guān)系，且均有一個極大值點。在當前實驗范圍內(nèi)，當鹽濃度或pH為高水平時，OD值隨pH或鹽濃度升高先升高后降低;當鹽濃度或pH為低水平時，OD值隨pH或鹽濃度升高不斷降低。OD值變化速率顯示，pH和鹽濃度對PSB－B菌生長影響相差不多，等高線接近圓形，說明pH和鹽濃度的交互作用不顯著。

圖6 pH和NaCl對PSB－B菌生長影響Fig.6 Response surface for the effect of pH and NaCl on the growth of bacteria PSB－B

三組圖直觀地反映了各個因素對響應(yīng)值的影響，利用Design－Expert軟件進行實驗結(jié)果優(yōu)化，本實驗主要目的在于優(yōu)化PSB－B菌最適生長條件，通過分析得到優(yōu)化結(jié)果為:當溫度27.94℃，pH6.80，NaCl 0.25g/100mL時，光合細菌吸光度最大，為1.364。

2.2.3 實驗結(jié)果驗證 為檢測響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，再次進行實驗，采用上述優(yōu)化條件進行3次平行實驗 實際測得的平均實驗OD值為1.446。實驗值與理論值相對誤差為≤8%，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面優(yōu)化PSB－B菌生長條件是可行的。

3 結(jié)論

本文報道的PSB－B菌株對培養(yǎng)條件的要求及適應(yīng)范圍，即通過單因素實驗研究影響PSB－B菌生長條件的主要因素，即溫度、pH和鹽濃度。利用Design－Expert設(shè)計軟件，采用旋轉(zhuǎn)中心組合實驗設(shè)計法建立優(yōu)化PSB－B菌最適生長條件的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)回歸分析可知PSB－B菌最適生長條件是:溫度28℃、pH6.80、NaCl 0.25g/100mL。為進一步研究提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］夏兵兵，康建平，蘇波，等.沼澤紅假單胞菌發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2010，46(4):29－35.

［2］ Hong J L.Effects ofphoto catalysis on biological decolonization reactor and biological activity of isolated photosynthetic bacteria［J］ .Journal of Bioscience and Bioengineering，2003，96(3):298－303.

［3］Wu S B，Liang W Z.Purification of As－ CMP effluent by combined photosynthetic bacteria and coagulation treatment［J］.Journal of Environmental Sciences，2000，12(1):81－85.

［4］Dincer A R，Kargi F.Performance of rotating biological disc system treating saline wastewater［J］.Process Biochemistry，2001，36(8):901－906.

［5］Takeno K，Yamaoka Y，Sasaki K.Treatment of oil－ containing sewage wastewater using immobilized photosynthetic bacteria［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2005，21(8－9):1385－1391.

［6］Nagadomi H，Takahasi T，Sasaki K，et al.Simultaneous removal of chemical oxygen demand and nitrate in aerobic treatment of sewage wastewater using an immobilized photosynthetic bacterium of porous ceramic plates［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2000，16(1):57－62.

［7］黃志勇，王海勝，蔣培霞，等.幾株光合細菌的分離鑒定及在養(yǎng)殖羅非魚中的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)通報，2005，32(4):72－78.

［8］徐麗麗，莊傳東，賈友敦，等.光合細菌最佳生長條件篩選［J］.生物技術(shù)，2007，17(2):77－82.

［9］操玉濤，陳剛，劉立鶴，等.光合細菌M－01的培養(yǎng)條件優(yōu)化研究［J］.生物學(xué)雜志，2006，23(1):26－51.

［10］謝紅剛，王三反，褚潤.光合細菌培養(yǎng)條件的研究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2007，30(5):19－20.

［11］王永宏，張強，張興 .響應(yīng)面法優(yōu)化 Xenorhabdus nematophila發(fā)酵培養(yǎng)基的研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，37(7):140－146.

［12］趙衛(wèi)星，孫治強，高玉紅，等.響應(yīng)面法優(yōu)化百部總生物堿提取工藝的研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，36(7):185－190.

［13］岳田利，王云燕，袁亞宏，等.短乳桿菌產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶培養(yǎng)基的響應(yīng)面法優(yōu)化［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，37(1):217－224.

［14］于艷琴，李璘佼，車振明.響應(yīng)面法優(yōu)化腐乳生產(chǎn)中的培菌條件［J］.中國食品學(xué)報，2010，10(5):183－187.