劉勝利 張建華 俞雄杰 周 龍 林進(jìn)皇 余 海 郁毅剛▲

1.解放軍第一七五醫(yī)院暨廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院神經(jīng)外科，福建漳州 363000；2.解放軍73131部隊(duì)，福建漳州 363000

在現(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)中，火炮打擊帶來(lái)的爆震性損傷，仍是部隊(duì)減員最為重要的原因之一。而火炮打擊后，除可見(jiàn)的肢體損傷外，由此引起的應(yīng)激炎癥反應(yīng)綜合征，對(duì)有生力量戰(zhàn)斗力的影響不可忽視。本實(shí)驗(yàn)探討了在模擬實(shí)戰(zhàn)情況下火炮打擊后，爆震傷引起的兔的應(yīng)激炎癥反應(yīng)綜合征的情況，在之前筆者分別探討了卵巢、血清自由基等組織器官對(duì)于應(yīng)激反應(yīng)的病理及免疫組織化學(xué)的形態(tài)學(xué)變化[1-2]。本實(shí)驗(yàn)主要探討腸組織病理改變及免疫組織化學(xué)中的NMDAr1（N-methyl-D-asparate receptor-1，NMDAr1）受體在腸應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及動(dòng)物

團(tuán)進(jìn)攻炮火覆蓋火力類(lèi)型：武裝直升機(jī)火箭彈、XX自行榴彈炮、XX牽引加農(nóng)炮、XX自行火箭炮、水陸兩棲坦克、XX輪式突擊炮、XX迫擊炮、XX反坦克導(dǎo)彈。健康成年日本大耳白兔30只，雌雄不拘，清潔級(jí)，體質(zhì)量2.5～3.0 kg（廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供）；按照隨機(jī)表法分為3組，空白對(duì)照組6只、反角隱蔽組6只、迎面隱蔽組18只（距離攻擊目標(biāo)10 m隱蔽組6只，20 m隱蔽組6只，30 m組隱蔽6只）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

按照文獻(xiàn)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)[1]，實(shí)驗(yàn)時(shí)間和環(huán)境條件為南方秋季中午山地環(huán)境，環(huán)境溫度16～28℃，濕度為43%～65%。實(shí)驗(yàn)兔常規(guī)喂養(yǎng)，演習(xí)當(dāng)日凌晨運(yùn)至目標(biāo)高地，炮靶前迎面10、20、30 m處挖掘約1 m深掩體，各放置實(shí)驗(yàn)兔6只，上覆蓋硬質(zhì)木板、松枝，留通氣道。炮靶后反角10 m處挖掘同樣掩體，放置實(shí)驗(yàn)兔6只?？瞻讓?duì)照組于炮靶陣地外10 km營(yíng)區(qū)喂養(yǎng)。中午演習(xí)開(kāi)始，全過(guò)程2 h。轟炸機(jī)俯沖（未投彈），持續(xù)火炮急襲5 min。各型火炮、坦克、導(dǎo)彈、武裝直升機(jī)集群連續(xù)發(fā)彈若干，期間暫停2次，各10 min。演習(xí)結(jié)束，工兵排爆清理陣地后進(jìn)場(chǎng)取回實(shí)驗(yàn)兔。傷后6 h處死存活兔解剖，取腸組織標(biāo)本，4%甲醛固定。

1.3 腸組織病理檢測(cè)

取4%甲醛固定腸組織，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化，由同一病理醫(yī)師采用盲法評(píng)價(jià)。觀察腸組織結(jié)構(gòu)層次是否完整，腸組織細(xì)胞腫脹、變性、壞死，間質(zhì)出血、水腫等情況。

1.4 腸組織NMDAr1免疫組織化學(xué)表達(dá)的測(cè)定

取4%甲醛固定腸組織，石蠟包埋，連續(xù)切片（4μm），每例標(biāo)本切5張免疫組織化學(xué)染色用。采用改進(jìn)型SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明操作。試劑盒型號(hào)，購(gòu)于XX公司。每次染色時(shí)均用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS（磷酸緩沖液，0.01 mol/L，pH 值 7.2）代替一抗作陰性對(duì)照。NMDAr1表達(dá)均位于胞質(zhì)和胞核內(nèi)，表現(xiàn)為淺黃、棕黃或棕褐色。用半定量法評(píng)估其染色，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（-），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為（+），25%～50%為（++），51%～75%為（+++），＞75%為（++++）。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)兔的一般情況

各組實(shí)驗(yàn)兔均無(wú)直接火力命中。與空白對(duì)照組比較，反角隱蔽組實(shí)驗(yàn)兔全部存活，部分精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、伏地，少部分耳道出血。因彈著點(diǎn)不規(guī)律，迎面隱蔽3組距離無(wú)差異，合并為一組。迎面隱蔽組18只實(shí)驗(yàn)兔當(dāng)場(chǎng)死亡9只，至傷后6 h取腸組織標(biāo)本前再死亡3只，死亡率達(dá)66.7%（12/18）。剩余6只存活實(shí)驗(yàn)兔編為迎面隱蔽組，與另外兩組同時(shí)刻點(diǎn)取腸組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測(cè)，每只取5張切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)表達(dá)強(qiáng)度及形態(tài)學(xué)觀察研究。

2.2 腸組織HE染色結(jié)果

空白對(duì)照組腸組織切片HE染色顯示，腸黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層完整，結(jié)構(gòu)均勻致密。環(huán)形皺壁表面存在多量不規(guī)則形狀柱狀絨毛，其間上皮及固有層完整。上皮間混雜杯狀細(xì)胞。絨毛中心為結(jié)締組織，可見(jiàn)黏膜下神經(jīng)叢。絨毛基底可見(jiàn)潘氏細(xì)胞和肌間神經(jīng)叢分布，肌漿深染，膠質(zhì)豐富，可見(jiàn)散在分布血管，腔內(nèi)少量紅細(xì)胞，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞（圖1、圖2）。反角隱蔽組腸組織切片HE染色顯示，分層結(jié)構(gòu)存在。柱狀絨毛上皮頂部變性壞死，局部脫落，上皮細(xì)胞胞質(zhì)空泡變性；細(xì)胞間少量紅細(xì)胞，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3、圖4）。迎面隱蔽組腸組織切片HE染色顯示，細(xì)胞結(jié)構(gòu)層紊亂，分界不清，部分壞死，崩解；細(xì)胞數(shù)明顯減少，黏膜層及下層和肌層分離；可見(jiàn)散在紅細(xì)胞分布，漿細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 5、圖 6）。

2.3 腸組織NMDAr1免疫組織化學(xué)的表達(dá)

空白對(duì)照組見(jiàn)柱狀絨毛完整，絨毛中心固有層可見(jiàn)分布NMDAr1表達(dá)陽(yáng)性神經(jīng)叢棕染，NMDAr1蛋白少量表達(dá)（+）（圖7、圖 8）；反角隱蔽組可見(jiàn)絨毛腫脹，固有層變性，細(xì)胞減少，黏膜上皮細(xì)胞中神經(jīng)叢廣泛棕染（++），NMDAr1中量表達(dá)（圖9、圖10）；迎面隱蔽組，可見(jiàn)絨毛壞死崩解，全部胞質(zhì)、胞膜均棕染，色深。NMDAr1大量表達(dá)（++++）（圖11、圖12）。迎面隱蔽組、反角隱蔽組NMDAr1免疫反應(yīng)強(qiáng)度均高于對(duì)照組，迎面隱蔽組NMDAr1免疫反應(yīng)強(qiáng)度亦高于反角隱蔽組。

2.4 NMDAr1表達(dá)與組織病理的關(guān)系

通過(guò)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的觀察，空白對(duì)照組、反角隱蔽組與迎面隱蔽組NMDAr1免疫組織化學(xué)的表達(dá)量逐漸遞增，腸的病理改變也由可逆的變性加重為不可逆的壞死（表1）。

表1 NMDAr1表達(dá)與組織病理的關(guān)系

3 討論

在火炮打擊后，對(duì)比空白對(duì)照組、反角隱蔽組及迎面隱蔽組3組的生存率，發(fā)現(xiàn)反角掩體兔的存活率為100.0%（18/18），而迎面隱蔽組死亡率高達(dá) 66.7%（12/18），其有力地說(shuō)明戰(zhàn)地反角隱蔽可有效保證在密集火炮打擊下生存。同時(shí)，也可說(shuō)明迎面角投彈可有效消滅敵軍。此外，如何減輕有生力量對(duì)炮擊帶來(lái)的爆震、彈片、噪聲、應(yīng)激、精神損傷等復(fù)合性損傷，保障有生力量的戰(zhàn)斗力也極為重要。目前研究表明[3-6]，加強(qiáng)日常訓(xùn)練，模擬戰(zhàn)場(chǎng)環(huán)境訓(xùn)練，綜合衛(wèi)生心理訓(xùn)練，改善機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況及傷后心理護(hù)理，均可提高機(jī)體應(yīng)激適應(yīng)能力。

眾所周知，應(yīng)激反應(yīng)是把“雙刃劍”，一般情況下的應(yīng)激反應(yīng)是對(duì)人有利的，但長(zhǎng)時(shí)間過(guò)于強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)給人帶來(lái)?yè)p傷。臨床上因重型損傷導(dǎo)致的應(yīng)激性消化潰瘍較為常見(jiàn)。目前研究表明，腸的應(yīng)激性損傷主要與腦-腸軸相關(guān)，而較早所認(rèn)知的下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)（HPA軸），內(nèi)臟高敏效應(yīng)、精神心理等因素可能僅是其在胃腸道應(yīng)激作用中的具體表現(xiàn)[7-10]。胃腸道直接或間接的受中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)的共同支配[11-12]，并通過(guò)共同的遞質(zhì)——腦腸肽，建立起腦-腸軸調(diào)節(jié)的通路。已證實(shí)的腦腸肽包括組胺、5-羥色胺（5-HT）、一氧化氮（NO）、去甲腎上腺素（NE）、神經(jīng)降壓素（NT）、P 物質(zhì)（SP）、降鈣素相關(guān)肽（CGRP）、血管活性腸肽（VIP）等[13]。這些物質(zhì)通過(guò)直接或間接影響胃腸平滑肌蠕動(dòng)、血管的收縮、腺體的分泌實(shí)現(xiàn)對(duì)胃腸道的作用。較為深入地研究腦-腸軸的關(guān)系，明確腦腸肽在導(dǎo)致腸應(yīng)激損傷通路中的節(jié)點(diǎn)，可確定藥物治療的新靶點(diǎn)，為探索新的預(yù)防與治療方法提供思路。

NMDAr1是一種興奮性氨基酸的特異性離子型受體，主要分布于大腦皮質(zhì)、丘腦、紋狀體、海馬等的突出后膜上，此外其在脊髓背角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突中也有分布，并延伸到內(nèi)臟神經(jīng)末梢。目前研究表明，其與應(yīng)激反應(yīng)主要的通路HPA軸有著密切的關(guān)系[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著兔的腸應(yīng)激性病理改變的加重，NMDAr1在腸內(nèi)的免疫組織化學(xué)表達(dá)量逐步增加。而Varga G等[15]研究證實(shí)，通過(guò)抑制NMDAr1受體可降低腸炎模型小鼠的炎癥反應(yīng)，表明NMDAr1參與了爆炸及爆炸應(yīng)激狀態(tài)下腸組織病理?yè)p傷過(guò)程。其可能的作用機(jī)制有以下幾個(gè)方面：①中樞的NMDAr1通過(guò)激活HPA軸促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的分泌和釋放，介導(dǎo)炎癥應(yīng)激反應(yīng)[16]。葉建寧等[17]通過(guò)測(cè)定嚴(yán)重燙傷小鼠海馬NMDAr1受體的表達(dá)研究認(rèn)為，NMDAr1減弱了腎上腺皮質(zhì)激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而引起腎上腺皮質(zhì)激素大量分泌。②NMDAr1通過(guò)降低胃黏膜VCL的表達(dá)，導(dǎo)致胃黏膜組織屏障發(fā)生變化，使胃酸、胃蛋白酶等更容易破壞黏膜的完整性[18]。③外周NMDAr1受體增強(qiáng)外周高敏化[19]，Du J等[20]應(yīng)用電生理學(xué)單纖維記錄方法發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài)下給予NMDAr1可以誘發(fā)27%左右的C纖維放電，而在足底注射CFA后，NMDAr1誘發(fā)C纖維放電的概率（86%）和頻率顯著增加，并且誘發(fā)傷害性感受器放電所需的NMDAr1閾值濃度也較正常狀態(tài)明顯下降。痛閥的降低使應(yīng)激變的更加敏感，應(yīng)激的強(qiáng)度相應(yīng)增高。④外周NMDAr1受體增強(qiáng)了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。在炎癥和損傷情況下，外周傷害性感受器持續(xù)受到刺激，導(dǎo)致中樞終末釋放的神經(jīng)遞質(zhì)增多，引起脊髓背角突觸后神經(jīng)元超興奮，該神經(jīng)元將超興奮的信息繼續(xù)向上傳遞到腦中樞從而產(chǎn)生慢性痛[21]。持續(xù)的慢性疼痛導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)，炎癥加重。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以清晰觀察到，兔的腸病理結(jié)構(gòu)改變由輕到重時(shí)，NMDAr1的表達(dá)量也由（+）增加至（++++），這也佐證了目前對(duì)于NMDAr1的研究，NMDAr1在低水平量時(shí)，其介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，起到自我保護(hù)作用，當(dāng)其超過(guò)保護(hù)機(jī)制的臨界點(diǎn)時(shí)，將損傷機(jī)體。由此，一旦確定NMDAr1損傷機(jī)體的扳機(jī)點(diǎn)，將有可能在其介導(dǎo)炎癥前，采取阻斷措施，從而減輕對(duì)機(jī)體的損傷。可見(jiàn)今后對(duì)于NMDAr1介導(dǎo)炎癥通路及其扳機(jī)點(diǎn)的探討，或者針對(duì)更加廣泛的全身應(yīng)激反應(yīng)綜合征的多通路、多指標(biāo)的探討，對(duì)于預(yù)防治療應(yīng)激性病變將產(chǎn)生不可估量的作用。

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