楊顏慈，郭 斌，殷 紅

(西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建教育部實(shí)驗(yàn)室陜西省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710069)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)今生物工程領(lǐng)域中的前沿研究課題之一，培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞可以分離和鑒定病毒、進(jìn)行遺傳、代謝及發(fā)育調(diào)節(jié)方面的研究，并可利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)與人類健康和生存密切相關(guān)的生物制品，如疫苗、基因重組蛋白質(zhì)、抗體藥物、基因治療藥物等［1］。通常，動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)有賴于血清的存在，在傳統(tǒng)的天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基中，如果不加血清，絕大部分細(xì)胞將不能增殖。但使用血清又存在著道德和科學(xué)上的問(wèn)題［2］，如對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害、存在潛在的污染源、不同批次血清間的生物活性和因子的不一致及價(jià)格高等諸多弊端。在2003年4月5日至7日，Vera Baumans和Jan van der Valk組織召開(kāi)了一場(chǎng)專題討論會(huì)議，主題是“改進(jìn)體外培養(yǎng)技術(shù)方法，減少胎牛血清在細(xì)胞、組織培養(yǎng)上的應(yīng)用”［2］。2009年在哥本哈根一場(chǎng)類似的專題會(huì)議召開(kāi)，會(huì)議討論了可以提高無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)發(fā)展及利用的策略［3］。有大量實(shí)踐證明無(wú)血清培養(yǎng)基不僅能在很大程度上避免或改善含血清培養(yǎng)基所帶來(lái)的上述缺陷，而且也能取得良好的培養(yǎng)效果。因此，無(wú)血清培養(yǎng)基得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

1 無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展過(guò)程

從1975年垂體細(xì)胞株 Gh3在無(wú)血清介質(zhì)中生長(zhǎng)獲得成功到現(xiàn)在，無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展大致經(jīng)歷了3代［4］，即第一代一般意義上的無(wú)血清培養(yǎng)基，第二代無(wú)血清無(wú)動(dòng)物衍生蛋白培養(yǎng)基，第三代雙無(wú)培養(yǎng)基。隨著科技的進(jìn)步，第四代無(wú)血清培養(yǎng)基的研究開(kāi)發(fā)并投入市場(chǎng)將成為發(fā)展趨勢(shì)。其各自的成分、優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用見(jiàn)表 1［4-7］。

表1 無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展過(guò)程Table 1 The development process of serum-free medium

2 無(wú)血清培養(yǎng)基成分的改進(jìn)

無(wú)血清培養(yǎng)基的成分十分復(fù)雜，一般認(rèn)為其由兩部分組成，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充因子。基礎(chǔ)培養(yǎng)基是各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物，是維持組織或細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳、繁殖等一系列生命活動(dòng)必不可少的物質(zhì)。目前應(yīng)用最廣泛的是 MEM、DMEM、RPMI1640等。補(bǔ)充因子是無(wú)血清培養(yǎng)基中用于代替血清的各種因子的總稱。這些補(bǔ)充因子可使培養(yǎng)基既能滿足動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的要求，又能有效避免和消除含血清培養(yǎng)基的成分不明確、有批次間差異、常被病毒和支原體污染、血清來(lái)源不穩(wěn)定、細(xì)胞產(chǎn)品不易純化等問(wèn)題。補(bǔ)充因子可分為必需補(bǔ)充因子和特殊補(bǔ)充因子［7］。胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒幾乎是所有的細(xì)胞株在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)都需要的，即為必需補(bǔ)充因子［8］。特殊補(bǔ)充因子可分為:激素和生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁和鋪展因子、微量元素和低分子量營(yíng)養(yǎng)因子、酶抑制劑等［8］。

由于無(wú)血清培養(yǎng)基的成分相對(duì)比較清楚，所以人們可因培養(yǎng)目的及細(xì)胞種類，選擇合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或改變補(bǔ)充因子的種類及用量以達(dá)到更好地培養(yǎng)目的。主要在以下幾方面進(jìn)行了改進(jìn)。1)調(diào)整補(bǔ)充因子中生長(zhǎng)因子的種類及用量。Kumiko Iwata等［9］研發(fā)出一種適合于軟骨細(xì)胞快速生長(zhǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基成分是:生長(zhǎng)因子 FGF-2(100 ng/mL)、insulin(5 μg/mL)、EGF(10 pg/mL)、PDGF(625 pg/mL)、TGF-β(5 pg/mL)以及生物材料白蛋白、透明質(zhì)酸酶。他們用該培養(yǎng)基培養(yǎng)軟骨細(xì)胞10 d后，軟骨細(xì)胞的數(shù)量大約增長(zhǎng)了25倍，增殖能力是含血清培養(yǎng)基條件下的一倍左右。2)改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基。董書(shū)偉等［10］通過(guò)對(duì)比昆明小鼠原始生殖細(xì)胞(PGCs)在不同組分的無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加0.1 mmol/L維甲酸(RA)或使用條件培養(yǎng)基 MEF-CM和 GR-CM，均有利于小鼠 PGCs的增殖，其中 MEF-CM和GR-CM組的效果與細(xì)胞因子組相比差異不顯著且降低了培養(yǎng)基的成本。3)采用新的補(bǔ)充因子。田靚等對(duì)生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基的成分進(jìn)行了優(yōu)化，他們以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了抗 CD3人源化抗體的 CHO細(xì)胞為模型，將無(wú)血清培養(yǎng)基經(jīng)生物反應(yīng)器高密度細(xì)胞培養(yǎng)后分子量小于50kD的超濾液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)向其中添加2 mmol/L丁酸鈉可以有效地誘導(dǎo)蛋白的表達(dá);丁酸鈉和檸檬酸鐵對(duì)于促蛋白表達(dá)有協(xié)同作用，適量添加培養(yǎng)中消耗較快的氨基酸(絲氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸及亮氨酸)可提高蛋白數(shù)和蛋白的表達(dá)量［11］。張大鶴等［12］開(kāi)發(fā)出適于重組 CHO-K1 細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)動(dòng)物源、無(wú)蛋白培養(yǎng)基(PFM)及化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(CDM)。在 PFM中，以檸檬酸鐵、硫酸鋅和酵母水解物替換無(wú)血清、低蛋白培養(yǎng)基(SFMC)中的轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和動(dòng)物組織水解物。在CDM中，以PFM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，調(diào)整和優(yōu)化氨基酸的濃度和其他部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明兩種培養(yǎng)基均可穩(wěn)定支持CHO細(xì)胞培養(yǎng)，微量元素完全可以替換無(wú)血清培養(yǎng)基中的蛋白，支持細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)蛋白表達(dá)。通過(guò)對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的優(yōu)化調(diào)整，不需添加任何小肽化合物，在去除培養(yǎng)基中的蛋白水解物后，仍能支持高密度的 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)［12］。

通過(guò)對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基成分的適當(dāng)調(diào)整、改進(jìn)，人們實(shí)現(xiàn)了對(duì)某一類細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物快速、專一的培養(yǎng)目的，但目前這種改進(jìn)還未大規(guī)模投入生產(chǎn)，且培養(yǎng)的細(xì)胞種類具有一定的局限性。

3 無(wú)血清培養(yǎng)基在基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)

由于無(wú)血清培養(yǎng)基具有組成成分相對(duì)清楚、性能更加一致、容易進(jìn)行純化和下游加工、培養(yǎng)細(xì)胞的功能可以精確評(píng)估、增強(qiáng)生長(zhǎng)和產(chǎn)量、生理反應(yīng)性可以較好對(duì)照、可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，從而在動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用日益廣泛。隨著近年來(lái)人們對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的不斷研究，其應(yīng)用與開(kāi)發(fā)也愈加廣泛。

3.1 用于生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生物制品

樊慶帥等［13］研發(fā)出一種適合 MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)MDCK-SFM，以用于狂犬病病毒的生產(chǎn)。用MDCK-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病病毒，可獲得較高的病毒滴度(5.13 IgFFU/mL)，且成本低，成分比較明確，在 MDCK細(xì)胞高密度培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬病疫苗方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)被廣泛的用作宿主細(xì)胞以生產(chǎn)重組蛋白用于臨床診斷［14］。孫亞婷等［15］以表達(dá)單克隆抗體的重組CHO細(xì)胞為研究對(duì)象，研發(fā)出能支持細(xì)胞高密度培養(yǎng)和產(chǎn)物高效表達(dá)的無(wú)血清培養(yǎng)基，以優(yōu)化后的無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)表達(dá)單克隆抗體的重組CHO細(xì)胞進(jìn)行批式培養(yǎng)，其最高活細(xì)胞密度可達(dá)6×106cells/mL，單克隆抗體濃度達(dá)200 mg/L，比HyClone SFM4CHO商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基中分別提高了50%和30%。

3.2 用于干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和研究

干細(xì)胞具有可分化成為不同功能細(xì)胞的全能性，大量的研究結(jié)果已經(jīng)表明干細(xì)胞將可能為目前許多不治之癥(如肝硬化、心肌梗死、糖尿病、白血病等)提供有效的治療手段，也是組織再生、器官移植等再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的希望所在，其重要性已經(jīng)得到人們的廣泛共識(shí)，干細(xì)胞研究和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展迅速［16］。目前無(wú)血清培養(yǎng)基已被廣泛用于干細(xì)胞的研究。方彥艷等［17］在無(wú)血清的人間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)體系條件下，利用臍帶組織培養(yǎng)法分離培養(yǎng)出大量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，避免了培養(yǎng)中異種蛋白的混入而降低臨床排異反應(yīng)。其實(shí)驗(yàn)表明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)易于誘導(dǎo)成骨，部分實(shí)現(xiàn)了篩選骨組織工程中候選的骨種子目的。陳請(qǐng)國(guó)等［18］利用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，以觀察其生長(zhǎng)及分化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)論是:神經(jīng)干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛，8 d左右就可以形成胞體透亮、折光性好的干細(xì)胞球;神經(jīng)干細(xì)胞的分化受微環(huán)境的影響，不同的生長(zhǎng)因子能誘導(dǎo)其朝不同方向分化。

3.3 用于腫瘤的研究

腫瘤是急待攻克的世界性難題，人們?cè)诓粩嘌芯恐[瘤的發(fā)生機(jī)制、轉(zhuǎn)移、治療等方面，以期達(dá)到治愈腫瘤的目的。由于無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)明顯，許多研究人員選擇它來(lái)培養(yǎng)富集腫瘤細(xì)胞用于后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)其有良好的富集效果;研究人員通過(guò)向培養(yǎng)基中添加一些化學(xué)生物物質(zhì)或藥物，以研究其對(duì)腫瘤的影響及腫瘤的病因、病理等方面。所以無(wú)血清培養(yǎng)基在腫瘤研究方面得到了廣泛應(yīng)用。李雅婷等［19］用加了20 μ g/L EGF和20 μ g/L bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)SP2/0細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)無(wú)血清培養(yǎng)條件下的SP2/0細(xì)胞比普通培養(yǎng)條件下的SP2/0細(xì)胞有更高的致瘤性和有更多的腫瘤干細(xì)胞(TSC)。雖然用無(wú)血清培養(yǎng)沒(méi)有能夠得到由SP2/0細(xì)胞TSC形成的腫瘤球，但是它對(duì)SP2/0細(xì)胞的TSC有富集作用。王欣榮等［20］利用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1，發(fā)現(xiàn)4T1細(xì)胞可在含多種生長(zhǎng)因子的SFM中懸浮生長(zhǎng)并形成細(xì)胞球，4T1細(xì)胞中含有的乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞可通過(guò)SFM培養(yǎng)法富集。

3.4 用于從多種細(xì)胞混雜的培養(yǎng)中選擇目的細(xì)胞

通過(guò)對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基中的某些成分含量的調(diào)整或取舍，可抑制原代組織培養(yǎng)物中非目的細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，達(dá)到選擇目的細(xì)胞的目的。胡祥等［21］旨在檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系 SW480中側(cè)群細(xì)胞(Side population，SP)亞群(SP細(xì)胞是一類不均一的群體，來(lái)源于成體組織的特殊干細(xì)胞類型，由不同等級(jí)的干細(xì)胞亞群組成，各亞群之間的表面抗原標(biāo)記和細(xì)胞類型等存在較大的差異)，他們采用添加了表皮生長(zhǎng)因子20 μl/L、堿性成纖維生長(zhǎng)因子10 μ g/L的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，初步分離、富集腫瘤干細(xì)胞樣亞群。曾志勇等［22］采用無(wú)血清培養(yǎng)基 K-SFM培養(yǎng)人食管上皮細(xì)胞，培養(yǎng)基成分是左旋谷氨酰胺、表皮生長(zhǎng)因子及牛垂體提取物，在使用之前還添加了雙抗(青霉素、鏈霉素)，0.5 mg/L氫化可的松和5 mg/L胰島素。他們發(fā)現(xiàn)與常規(guī)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)相比，在 K-SFM培養(yǎng)液中，成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受抑，而食管上皮細(xì)胞具有生長(zhǎng)形態(tài)好、活力旺盛、增殖力強(qiáng)、細(xì)胞融合快、不易老化等優(yōu)點(diǎn)。

3.5 研究細(xì)胞體外分化的條件或方法

無(wú)血清培養(yǎng)基的組成可以是完全確知的化學(xué)物質(zhì)，因而可根據(jù)研究的需要增減具有重要生物活性物質(zhì)的種類和數(shù)量，這就為研究細(xì)胞分化的條件提供了有效的手段。Jeffrey R.Crawford等［23］認(rèn)為采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞可以快速有效地研究一些因子對(duì)成纖維細(xì)胞分化的影響。采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)鼠科動(dòng)物的脾細(xì)胞，5天內(nèi)分化為成纖維細(xì)胞。因子IL-13(白介素-13)和M-CSF可以在很大程度上增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的分化，增強(qiáng)分化的最優(yōu)細(xì)胞密度是1.75×106cells/mL。SAP和交聯(lián)免疫球蛋白G會(huì)抑制小鼠脾細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞。馮年花等［24］研究了人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)體外定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的方法，他們將人 iPS細(xì)胞懸浮培養(yǎng)4d形成擬胚體(EB)后經(jīng)維甲酸(RA)誘導(dǎo)4d，誘導(dǎo)后的 EB在無(wú)血清培養(yǎng)基中篩選并擴(kuò)增培養(yǎng)，得到的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光檢測(cè)到 NSCs的標(biāo)志物質(zhì)。其研究表明:維甲酸(RA)結(jié)合無(wú)血清培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)能高效率地獲得NSCs。Fang Ning等［25］的研究表明成釉細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)基(ameloblasts serum-free conditioned medium，ASF-CM)是一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)分化成口腔上皮細(xì)胞的良好方法。他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng) 14d后，成釉細(xì)胞特有蛋白:CK14、AMBN、AMGN的表達(dá)量的高低與 mESCs是否形成類胚體(EB)有關(guān)，在有EB形成的 mESCs中其表達(dá)量會(huì)高。其研究也顯示:ASF-CM能夠有效的誘導(dǎo) mESCs通過(guò)形成EB，進(jìn)而形成成釉細(xì)胞狀細(xì)胞的途徑分化。

3.6 用于激素、生長(zhǎng)因子和藥物等與細(xì)胞相互作用的研究

Christian Riebeling等［26］以無(wú)血清培養(yǎng)基為基質(zhì)，研究一些特定的生長(zhǎng)因子對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞株D3分化的作用。他們將含有生長(zhǎng)因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4、激活素A和抗壞血酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞株D3，發(fā)現(xiàn)其分化為心肌。此外，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記蛋白，發(fā)現(xiàn)它不僅分化為心肌細(xì)胞，同時(shí)也分化為神經(jīng)細(xì)胞。他們的這種方法可以應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)對(duì)早期中胚層和神經(jīng)外胚層分化發(fā)育的影響。

4 展望

在無(wú)血清培養(yǎng)基出現(xiàn)至今的短短幾十年中，已經(jīng)歷了三次大的發(fā)展，雖然至今仍有諸多不足，如適用范圍窄、培養(yǎng)基相對(duì)較難保存、成本較高等。但隨著人們對(duì)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)與代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及外源蛋白表達(dá)機(jī)制等各方面機(jī)理認(rèn)識(shí)的不斷深入以及細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與研究中更多科學(xué)便捷的方法技術(shù)的成熟和采用，必將為無(wú)血清培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)及改善提供快捷通道［4］。因此，相信無(wú)血清培養(yǎng)基必將克服其不足，取得更大的突破，如適合多種細(xì)胞生長(zhǎng)，具有廣泛適用性、生產(chǎn)高效性，降低成本及安全風(fēng)險(xiǎn)，與發(fā)酵罐技術(shù)良好結(jié)合等，使之更廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐和基礎(chǔ)研究，特別是對(duì)干細(xì)胞和癌癥機(jī)理的研究，為人類造福。

［1］王 捷.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004，1-7.

［2］van der Valk J，Mellor D，Brands R，et al.The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture［J］.Toxicology in Vitro，2004，18(1):1-12.

［3］van der Valk J，Brunner D，De Smet K，et al.Optimization of chemically defined cell culture media-replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods［J］.Toxicology in Vitro，2010，24(4):1053-1063.

［4］楊學(xué)義，劉 飛，向雙云，等.哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32(2):69-72.

［5］王永民，陳昭烈.動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的研究與設(shè)計(jì)方法［J］.中國(guó)生物工程雜志，2007，27(1):110-114.

［6］梅建國(guó)，莊金秋，沈志強(qiáng).動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)，2010，20(3):87-89.

［7］陳 鋒.無(wú)血清培養(yǎng)基的主要補(bǔ)充因子及研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2006，18(4):10-13.

［8］殷 紅.細(xì)胞工程［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:128-130.

［9］Iwata K，Asawa Y，Nishizawa S，et al.The development of a serum-free medium utilizing the interaction between growth factors and biomaterials［J］.Biomaterials，2012，33(2):444-454.

［10］董書(shū)偉，馮秀亮，段艷萍，等.昆明小鼠原始生殖細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的篩選［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，36(4):27-31.

［11］田 靚，寇 庚，錢衛(wèi)珠，等.分泌重組抗體的CHO細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.生物技術(shù)，2004，14(2):39-41.

［12］張大鶴，易小萍，張?jiān)d，等.適于重組CHO細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，24(10):1152-1156.

［13］樊慶帥，牛紅星，吳書(shū)軍，等.無(wú)血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病病毒條件的初步優(yōu)化［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2009，22(11):1136-1140.

［14］Sakai K，Matsunaga T，Hayashi C，et al.Effects of phosphatidic acid on recombinant protein production by Chinese hamster ovary cells in serumfree culture［J］.Biochemical Engineering Journal，2002，10(2):85-92.

［15］孫亞婷，范 里，劉旭平，等.支持重組CHO細(xì)胞高密度培養(yǎng)和產(chǎn)物高效表達(dá)的無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)化［C］.見(jiàn):第六屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文集，第六屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)，長(zhǎng)沙，2010.

［16］陳 濤，錢萬(wàn)強(qiáng).國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展態(tài)勢(shì)分析［J］.中國(guó)科技論壇，2011，10:150-153.

［17］方彥艷，馬 健.無(wú)血清培養(yǎng)基分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究［J］.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，31(5):21-24.

［18］陳請(qǐng)國(guó)，付 勇，王顯紅，等.大鼠神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖規(guī)律的體外研究［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2008，22(16):747-750.

［19］李雅婷，竇 駿，趙楓姝，等.無(wú)血清培養(yǎng)的SP2/0細(xì)胞腫瘤學(xué)特性的研究［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19(1):20-23.

［20］王欣榮，單保恩，艾 軍，等.小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的富集和鑒定［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2010，17(4):381-385.

［21］胡 祥，程 勇，王吉明，等.結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480腫瘤干細(xì)胞相關(guān)亞群初步分離、鑒定［J］.中國(guó)癌癥雜志，2008，18(7):496-500.

［22］曾志勇，鮑春榮，丁芳寶，等.人食管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良研究［J］.臨床軍醫(yī)雜志，2009，37(4):537-539.

［23］Crawford J R，Pilling D，Gomer R H.Improved serum-free culture conditions for spleen-derived murine fibrocytes［J］.Journal of Immunological Methods，2010，363(1):9-20.

［24］馮年花，謝 安，婁遠(yuǎn)蕾，等.人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法探討［J］.中國(guó)病理生理雜志，2010，26(8):1662-1664.

［25］Ning F，Guo Y S，Tang Juan，et al.Differentiation of mouse embryonic stem cells into dental epithelial-like cells induced by ameloblasts serumfree conditioned medium［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，394(2):342-347.

［26］Riebeling C，Schlechter K，Buesen R，et al.Defined culture medium for stem cell differentiation:applicability of serum-free conditions in the mouse embryonic stem cell test［J］.Toxicology in Vitro，2011，25(4):914-921.