張玉波，凌 琪，陶 勇，楊偉偉

(1.安徽建筑工業(yè)學(xué)院教務(wù)處，合肥230601;2.安徽建筑工業(yè)學(xué)院環(huán)境與能源工程學(xué)院，合肥230601)

任何生物體的生長都遵循一定的規(guī)律，都要受外界環(huán)境條件影響。研究明確適宜的溫度、pH值和光周期等生物學(xué)特性，才能成功地應(yīng)用它們。環(huán)鏈擬青霉是擬青霉屬(Paecilocyes Bainier)的一個種，粉擬青霉是自然界中控制昆蟲種群的重要因子之一，玫煙色擬青霉昆蟲寄主多樣，是一種重要的昆蟲病原真菌。近年來，隨著害蟲對單一菌種的免疫力增強(qiáng)，混菌防治害蟲顯得越來越重要，為此了解它們生物學(xué)特性方面的差異對開發(fā)和利用混菌防治資源具有重要意義［1-8］。

1 材料和方法

1.1 菌種及其來源

將3種采集到的標(biāo)本在選擇性培養(yǎng)基上多次分離純化，通過鏡檢其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)來鑒定真菌的屬種［9］。得知3種真菌分別為擬青霉屬的環(huán)鏈擬青霉、粉擬青霉和玫煙色擬青霉，具體3種供試擬青霉菌株拉丁文、寄主名稱和地理來源見表1。

表1 3種供試菌株的拉丁文、寄主名稱及地理來源Table 1 Latin，the name of the host and geographic origins of three tested isolates

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g;葡萄糖20 g;瓊脂20 g;蒸餾水1000 mL。

1.3 方法

1.3.1 生長曲線測定

液體種子制備 將PDA液體培養(yǎng)基分裝到250 mL搖瓶內(nèi)，每個搖瓶裝100 mL，120℃高壓蒸汽滅菌20 min，在無菌接種臺上將3種擬青霉從水液保存管中接種到搖瓶內(nèi)，放置于25℃、140 r/min的搖床上培養(yǎng)60 h。

生物量測定 將液體種子在無菌條件下用高速分散器打勻，微量取樣器取2 mL接種到裝有18 mL PDA培養(yǎng)基的50 mL搖瓶中，放置于25℃、140 r/min的搖床上培養(yǎng)。每個菌種設(shè)有3個重復(fù)。每天用抽濾瓶對20 mL的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次搖瓶后，收集菌絲體置于55℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重后，電子天平準(zhǔn)確稱重，得菌絲干重(生物量)［10］。

1.3.2 菌落生長量和產(chǎn)孢量測定

將鋪有玻璃紙的PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的菌落，用直徑為0.3 mm的打孔器在距培養(yǎng)皿中心相同位置打孔，無菌條件下接種到PDA培養(yǎng)基上，倒置于25℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個菌種設(shè)有3個重復(fù)。每天用游標(biāo)卡尺從菌落的兩個垂直方向進(jìn)行精確測量。

在測上述擬青霉生長量的同時，菌落生長到第10 d和第14 d時，用直徑為0.3 mm的打孔器在距菌落中心相同位置截取菌塊3個，放入20 mL 1‰的吐溫80溶液中，用高速分散器將菌塊充分打散配成孢子懸浮液。在顯微鏡下用血球計數(shù)板測定孢子的數(shù)目。

1.3.3 生長適溫測定

將鋪有玻璃紙的PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的菌落，用打孔器在距培養(yǎng)皿中心相同位置打孔，在無菌條件下接種到PDA培養(yǎng)基上，分別放置于15℃、20℃、25℃、30℃的光照培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。每個溫度處理均設(shè)有3個重復(fù)。每24 h用游標(biāo)卡尺從菌落兩個垂直方向進(jìn)行精確測量。當(dāng)菌落生長到第10 d、14 d時，用打孔器取菌塊，放入20 mL 1‰的吐溫80溶液中，用高速分散器將菌塊充分打散配成孢子懸浮液。在顯微鏡下用血球計數(shù)板測定孢子的數(shù)目［11］。

1.3.4 最佳pH值的測定

用500 mL三角瓶配制PDA培養(yǎng)基，在滅菌之前用緩沖液將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)到4、5、6、7、8、9、10，用直徑為0.3 mm的打孔器在鋪有玻璃紙的PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的菌落上距培養(yǎng)皿中心相同位置打孔，在無菌條件下分別接種到不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，放于25℃光照培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。每pH值中設(shè)有3個重復(fù)。每24 h用游標(biāo)卡尺測量直徑。當(dāng)菌落生長到第10 d、14 d時，測定孢子數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳生長曲線

由圖1可看出，3種擬青霉的生長曲線變化較明顯，即pc312、pfu53和pf273的最佳生長時間分別是6 d、7 d 和5 d。

2.2 最大菌落生長量和產(chǎn)孢量

圖1 3種擬青霉生長曲線Fig 1 Growth curve of the 3 different Paecilomyces spp

表2 3種擬青霉的菌落生長量和產(chǎn)孢量Table 2 Growth speed and conidiation of the 3 different Paecilomyces spp.

由表2可看出，3種擬青霉生長差異較顯著，其菌落生長量的次序為pfu53＞pc312＞pf273;其產(chǎn)孢速率的次序為pfu53＞pf273＞pc312。

2.3 最佳生長適溫

圖5 3種擬青霉的產(chǎn)孢情況Fig 5 Condition of the 3 different Paecilomyces spp.

由圖2、3和4可明顯得出，pc312在4個溫度梯度中除30℃外，其余3個溫度均可以生長。且最適溫度為25℃;pf273對30℃的高溫適應(yīng)很差，在其他3個溫度中都可以生長，且最適溫度為15℃;pfu53在30℃不能生長，在其余3個溫度梯度中均可以良好生長，且在15℃生長最佳。同時通過圖5也表明了產(chǎn)孢數(shù)量基本上和菌落直徑生長速度相一致的規(guī)律。

2.4 最佳生長pH值

圖9 3種擬青霉不同pH值下的產(chǎn)孢情況Fig 9 Conidiation of the three Paecilomyces spp.on the different pH

由圖6、7和8可以看出，pc312在pH值4～10中均有生長趨勢。其中在pH值為9的培養(yǎng)基上有明顯的生長優(yōu)勢;采用各個折點所對應(yīng)的菌落直徑數(shù)值進(jìn)行加權(quán)求平均的方法可以得出，pf273在pH值為7時生長最好。pfu53在最佳pH值為6時生長最佳。圖9的變化趨勢表明，3種擬青霉在第14 d的孢子數(shù)目和菌落的生長量呈同一規(guī)律:即pc312、pf273、pfu53所生長的最佳生長pH值分別為9、7、6。

3 討論與分析

3.1 本研究為了準(zhǔn)確描述菌落的性狀，采用了菌落生長量和產(chǎn)孢量兩個標(biāo)準(zhǔn)來衡量該屬菌種的生物學(xué)特性［12］。從而為林業(yè)上的生物防治和工業(yè)上的大量發(fā)酵生產(chǎn)提供有效的理論依據(jù)。

3.2 在研究轉(zhuǎn)接平皿的過程中，必須保證所轉(zhuǎn)接的種子沒有產(chǎn)孢或者產(chǎn)孢很少，以免在接種后，出現(xiàn)散孢的現(xiàn)象［13］。從而影響菌落直徑的測量，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。在不同溫度處理時，出現(xiàn)了菌落直徑和所取菌塊的孢子數(shù)目不符合的現(xiàn)象，通過比較分析發(fā)現(xiàn)是由于實驗中測定孢子數(shù)目時的誤差造成的。

3.3 通過對3種擬青霉的生物學(xué)特性分析，雖然它們同屬于一個屬，但它們之間的生物學(xué)差異較顯著。至于對出現(xiàn)這種差異的解釋，需要我們進(jìn)一步用實驗去探討。以期為混菌防治提供理論依據(jù)，打破害蟲對單一菌種的免疫力［14］。

3.4 在雨天多、濕度大、中低溫度下有利于松毛蟲卵的孵化及初孵幼蟲的生長發(fā)育，極易引起馬尾松毛蟲的大發(fā)生。通過分析，3種擬青霉均適宜中、低溫生活的菌株［15］。可以根據(jù)這一特點及馬尾松毛蟲生長發(fā)育的特性，在初春春雨或秋末秋雨來臨之際進(jìn)行林間噴灑擬青霉孢子粉，可能對馬尾松毛蟲等鱗翅目害蟲有較好的防治效果［16］。同時利用3種擬青霉生物學(xué)特性的差異可在年周期中的不同時段進(jìn)行林間交替施放，以期達(dá)到林間持續(xù)控制害蟲的防治效果。

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