李 曼，趙 芊，劉 方，李 浩，宋水山

(1.河北工業(yè)大學化工學院，天津300130;2.河北省科學院生物研究所，石家莊050081;3.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，石家莊050081)

在植物的生長發(fā)育中，由于細胞內(nèi)基因的表達存在著時間和空間的差異從而導致各細胞間出現(xiàn)分化，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的主要原因就是轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄因子通常具有模塊化結(jié)構(gòu)，即由DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域構(gòu)成。根據(jù)DNA結(jié)合功能域的相似性，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可以分為家族或超家族，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子是非常重要的一類，也是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的超家族之一［1］。隨著研究的深入，在植物中發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量急劇增加，在單一植物中發(fā)現(xiàn)的MYB家族成員達到100～200個，并且發(fā)現(xiàn)MYB蛋白調(diào)控植物新陳代謝以及細胞核發(fā)育過程［2］。目前關(guān)于動物MYB蛋白和它們相應(yīng)的DNA結(jié)合位點相互作用已經(jīng)有了深入的了解。但植物中MYB-DNA的相互作用還知之甚少。本文將概述植物MYB蛋白與其靶DNA相互作用的研究進展，并闡述研究植物MYB蛋白與其靶DNA相互作用的新技術(shù)。

1 植物MYB蛋白的特性

MYB蛋白首次發(fā)現(xiàn)于鳥類成髓細胞血癥病毒AMV中，其名稱即來源于 AMV病毒的致瘤因子v-MYB［3］。MYB超家族成員具有一個共同特征，即都具有一個高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，稱為 MYB結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常由3個包含50～53個氨基酸殘基的重復序列(R1、R2、R3)構(gòu)成(圖1)，每個重復序列含有多個高度保守的色氨酸殘基，由此形成規(guī)則的疏水核心［4］。重復序列形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)，有利于與DNA的結(jié)合。目前發(fā)現(xiàn)有些MYB蛋白含有至少4個這樣的重復結(jié)構(gòu)。MYB結(jié)構(gòu)域通常位于MYB蛋白的N端，最近也有發(fā)現(xiàn)其存在于蛋白質(zhì)的C端［5-6］。MYB蛋白的C端通常包含一個反式激活結(jié)構(gòu)域和一個負向調(diào)控結(jié)構(gòu)域，相較于MYB結(jié)構(gòu)域，C端序列具有非常大的可變性，用以區(qū)分不同的MYB蛋白。MYB蛋白的這種結(jié)構(gòu)特征，賦予了MYB超家族成員在結(jié)構(gòu)和功能上的多樣性［7］。

圖1 MYB轉(zhuǎn)錄因子功能域結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Functional domain map of MYB transcription factors structure

植物中存在著大量的MYB超家族蛋白。在雙子葉模式植物擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)的超過1600個序列特異的轉(zhuǎn)錄因子中，大約有10%屬于MYB超家族成員［8］。不同于動物，在植物中，具有2個重復序列(R2R3)的MYB蛋白占據(jù)主導地位。擬南芥中3重復序列(R1R2R3)的MYB蛋白有5個，而2重復序列(R2R3)的MYB蛋白有126個。單子葉模式植物水稻中經(jīng)預(yù)測有超過110個R2R3-MYB［9］。此外，單重復序列MYB蛋白在植物中也越來越多的被鑒定出來。植物R2R3-MYB蛋白參與調(diào)控多種生物學過程，包括初級代謝和次級代謝、調(diào)控細胞命運和特性、調(diào)控植物生長發(fā)育以及植物對生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)［10］。

2 植物MYB蛋白的DNA結(jié)合位點

植物的R1R2R3-MYB蛋白，例如煙草的MYBA1，MYBA2和MYBB蛋白，通過調(diào)控細胞周期蛋白B及其它細胞周期蛋白基因的表達，在細胞周期的G2/M期起重要作用［11］。通過酵母單雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)MtMYBA1，NtMYBA2和NtMYBB結(jié)合到序列AACGG上。這個共有序列已經(jīng)在煙草中被證實是有絲分裂M期特異激活子(MSA)元件。煙草中的另外兩個R1R2R3結(jié)構(gòu)MYB蛋白NtMYBC1和NtMYBC2經(jīng)生物信息學預(yù)測也是結(jié)合到MSA元件上，但這需要進一步實驗加以驗證。

目前對于植物R2R3-MYB蛋白的DNA結(jié)合位點的描述相對來說還比較少，這類蛋白的靶DNA序列是在進行玉米P蛋白的研究中首先被發(fā)現(xiàn)的。P蛋白是與類黃酮的生物合成有關(guān)的R2R3-MYB蛋白。通過結(jié)合位點的選擇性實驗和電泳遷移率變化分析(EMSAs)，顯示P蛋白結(jié)合的序列為ACC(A/T)ACC(A/C/T)。

MYB蛋白序列來自擬南芥信息資源網(wǎng)站 (TAIR;http://Arabidopsis.org)和美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI Entrez;http://www.ncvi.nlm.nih.gov/sites/entrez)。這個系統(tǒng)發(fā)育樹包含9個三重復結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白(R1R2R3-MYB proteins)，50個兩重復結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白(R2R3-MYB proteins)和28個單結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白(R1-MYB proteins)。利用快速傅里葉轉(zhuǎn)換的多重對比進行完整的氨基酸序列的對齊。通過運用分子進化遺傳分析軟件4(MEGA 4)建立遺傳樹?；贒NA序列的不同，把MYB蛋白標注上不同的顏色，紅色、藍色、綠色、橙色、紫色和灰色。MYB蛋白分別結(jié)合到序列 CNGTT(A/G)、ACC(A/T)A(A/C)、TTAGGG、AAAATATCT、GATA和TATCCA上。黑色表示MYB蛋白沒有結(jié)合到任一個序列上。

許多R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子可以識別富含A、C堿基的DNA序列。一些R2R3-MYB蛋白結(jié)合到這些結(jié)合位點處，作為轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮作用，另一R2R3MYB蛋白則作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮功能［12-14］。詳細的DNA結(jié)合位點信息可以在一些數(shù)據(jù)庫如擬南芥基因管理信息數(shù)據(jù)庫(AGRIS)(http://arabidopsis.med.ohio-state.edu/)和轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 (TRANSFAC)(http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html)中找到。這些數(shù)據(jù)庫中包含許多文獻中報道的MYB蛋白DNA結(jié)合位點，并且大多數(shù)經(jīng)過了實驗的驗證(圖2)。植物MYB蛋白DNA結(jié)合位點一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游大約500 bp處。和具有兩個或三個重復結(jié)構(gòu)的MYB蛋白相比，單獨重復結(jié)構(gòu)的MYB蛋白主要的結(jié)合在端粒序列TTAGGG，并顯示出相似的端粒一致性。單獨結(jié)合域的MYB蛋白涉及到端粒結(jié)合和生物鐘調(diào)節(jié)。羧基端和氨基端的單獨結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白結(jié)合在端粒重復序列TTTAGGG的雙鏈 DNA 上，AtTRB1、AtTRB2、AtTRB3結(jié)合在包含至少兩個TTTAGGG序列重復的端粒DNA上?？梢园l(fā)現(xiàn)，在MYB結(jié)構(gòu)域的初級序列方面和同源DNA目標結(jié)合位點上，這些單獨結(jié)構(gòu)域的 MYB蛋白與R2R3-MYB蛋白和R1R2R3-MYB蛋白有所不同。

3 植物MYB蛋白DNA結(jié)合的特性

3.1 MYB蛋白DNA結(jié)合域和DNA結(jié)合特異性之間的關(guān)系

基于序列的相似性，不同物種的R2R3-MYB家族成員被劃分為A、B和C三個系統(tǒng)發(fā)育大類［15］。氨基酸序列的高度相似性導致蛋白對DNA識別模式的相似性，從而使相同類型的MYB蛋白識別的靶DNA序列具有特異性。依據(jù)這些分類來分析DNA結(jié)合特異性。R2R3-MYB蛋白DNA結(jié)合位點的數(shù)據(jù)主要來源于體外測定的結(jié)果。結(jié)果顯示出A類MYB蛋白的DNA靶序列為 MBSI序列(C(A/C/G/T)GTT(A/G))，B類MYB蛋白的DNA靶序列為MBSI和MBSII序列(G(G/T)T(A/T)GTT(A/G))，大多數(shù)C類MYB蛋白的DNA靶序列為MBSIIG序列((C/T)ACC(A/T)A(A/C)C)。例如，C組成員AtMYB6和AtMYB7具有90%的氨基酸序列一致性［16］。AtMYB6和AtMYB7兩個都結(jié)合MBS類型IIG序列。

圖2 采用鄰接法方法對87個MYB超家族成員進行系統(tǒng)發(fā)生分類Fig 2 Phylogenetic relationships and subgroup designations for 87 MYB superfamily members using the neighbour-joining method

具有相似結(jié)構(gòu)的MYB超家族成員并不總是有類似的DNA結(jié)合位點。盡管Romero等已經(jīng)闡述過MYB蛋白結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)合特異性之間的關(guān)聯(lián)，但是有一些MYB家族的成員并不符合他的預(yù)想［15］。例如，MYB家族的C組成員一般更傾向于結(jié)合MBSIIG序列，但是有2個C類MYB蛋白AtMYB2和AtMYBGL1，以不同的模式結(jié)合 DNA。AtMYB2結(jié)合 MBSI的序列，而 AtMYBGL1只能結(jié)合MBSII序列［17］。這些例子說明即使在結(jié)構(gòu)和功能方面都相似的MYB蛋白也可能結(jié)合不同的DNA結(jié)合位點。因此針對每個MYB蛋白都進行DNA結(jié)合位點實驗至關(guān)重要。因為很難只是根據(jù)同源性來預(yù)測一個MYB蛋白的DNA結(jié)合位點。

3.2 植物MYB蛋白與DNA結(jié)合的本質(zhì)

迄今為止，由于任何一個多重復結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白的晶體結(jié)構(gòu)還未產(chǎn)生，所以關(guān)于一些植物MYB蛋白和目的DNA相互作用特性的研究是基于c-MYB蛋白與DNA結(jié)合的模型建立起來的。例如，PAP1/AtMYB75就是通過已知的c-MYB的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)模擬出其R2R3結(jié)構(gòu)域［18］。在多個MYB蛋白質(zhì)中找到了一段保守的氨基酸信號(［DE］Lx2［RK］x3Lx6Lx3R)，用來預(yù)測擬南芥蛋白質(zhì)新的MYB/BHLH互作。通過預(yù)測的PAP1/AtMYB75 3D模型的分析顯示，該保守基序的氨基酸暴露于R3重復結(jié)構(gòu)的α-螺旋1和2的表面，形成疏水和帶電殘基模式［19］。這些表滿暴露出來的氨基酸被認為用來穩(wěn)固蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用。這個模型通過突變分析實驗得到驗證［19］。

大多數(shù)的植物MYB蛋白在識別目標位點的能力上顯示出很重要的內(nèi)在多樣性。例如，矮牽?；ǖ鞍譓YB.Ph3可以以相同的親和力結(jié)合到MBSI和MBSII兩個位點上，并引起靶點DNA相似的彎曲和變形［20］。而其它植物MYB蛋白與這兩個DNA結(jié)合位點的親和力存在很大的不同，通常MYB蛋白只能結(jié)合其中一種DNA結(jié)合位點。

由于植物中存在大量的MYB蛋白，對應(yīng)于這些蛋白的下游DNA靶標數(shù)量也十分龐大。MYB蛋白參與調(diào)控的生物學過程也很廣泛，這決定了植物MYB蛋白與DNA相互作用的復雜性。至今MYB蛋白與DNA互作機制仍然是世界范圍內(nèi)的一大難題，還需要對此進行更廣泛深入的研究。

4 植物MYB蛋白和DNA相互作用研究展望

4.1 體外實驗確定MYB蛋白和靶標DNA序列

通過快速和高通量的方法在體外篩選MYB蛋白的DNA結(jié)合序列式來分析植物MYB蛋白與其靶標DNA相互作用所必須的。轉(zhuǎn)錄因子，包括MYB蛋白，能夠與多個目標序列相互作用并啟動轉(zhuǎn)錄。利用重組的MYB轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域從隨機DNA序列文庫中篩選靶標DNA的方法已經(jīng)很好的建立起來。這些方法包括CASTing(cyclic amplification and selection of targets)和SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)［21］。通過這些方法鑒定出了很多MYB轉(zhuǎn)錄因子的靶標DNA序列，并且這些方法在一定程度上實現(xiàn)了高通量篩選的目的?；谛酒募夹g(shù)，如蛋白質(zhì)結(jié)合芯片已經(jīng)被發(fā)展用來鑒定轉(zhuǎn)錄因子的序列特異性［22］。通過這一技術(shù)鑒定的結(jié)合位點序列與通過CHIP體內(nèi)實驗鑒定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列是相一致的［23］。

目前有兩種蛋白質(zhì)結(jié)合芯片類型:雙鏈DNA芯片和轉(zhuǎn)錄因子芯片。在大約240000個寡核苷酸中，雙鏈DNA芯片包含所有的11 bp長度(大約4.2百萬個)的序列［24］。來源于轉(zhuǎn)錄因子的重組蛋白和雙鏈DNA芯片雜交并且被高濃度的鹽類緩沖液沖洗。這個技術(shù)僅僅在一級雜交反應(yīng)中就能精確的檢測到所有被轉(zhuǎn)錄因子識別的DNA結(jié)合位點。

基于蛋白芯片，轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點需要捕獲大量多重的轉(zhuǎn)錄因子并且發(fā)現(xiàn)它們的結(jié)合位點。采用隨機的寡核苷酸文庫篩選轉(zhuǎn)錄因子，之后用不同濃度的鹽離子溶液洗脫。這兩種技術(shù)都是在短時間內(nèi)鑒別體外DNA結(jié)合蛋白位點高速有效的方法。然而，在這些實驗當中有一些局限性。一方面低濃度的鹽離子溶液會把結(jié)合力比較弱的蛋白-DNA結(jié)合物洗脫下去，造成結(jié)果有所偏差。另一方面，由于一部分蛋白和芯片雜交使得全部的蛋白并沒有結(jié)合到優(yōu)先的DNA上。

4.2 發(fā)現(xiàn)植物MYB蛋白目標的新方法和體外分析

重要的是，MYB蛋白在體外的DNA結(jié)合位點可能和在體內(nèi)的結(jié)合位點有所不同［25］。這些不同是因為體內(nèi)存在蛋白-蛋白之間的相互作用和翻譯后修飾改變了DNA結(jié)合特異性，而且體外重組的MYB蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象和這些結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)的天然構(gòu)象不同。此外體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點的有效性還受到染色質(zhì)內(nèi)基因組DNA組裝的調(diào)控。因此，采用在體內(nèi)實驗的方法精確地描述基因組中MYB-DNA的結(jié)合位點是必需的。

目前測定體內(nèi)一個特定的MYB蛋白結(jié)合到一個特定的DNA序列的主要方法是基因瞬時表達系統(tǒng)和酵母單雜交系統(tǒng)中完成的。首先分別構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子表達系統(tǒng)和包含假定DNA結(jié)合位點序列及報告基因的人工基因系統(tǒng)。將這兩個系統(tǒng)導入生物體內(nèi)，如植物或酵母菌中，通過在體內(nèi)觀察該轉(zhuǎn)錄因子的表達是否能夠激活報告基因的表達來檢測轉(zhuǎn)錄因子與假定DNA序列的結(jié)合情況。將擬南芥 R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子 AtMYB11，AtMYB12和AtMYB111在擬南芥原生質(zhì)體中瞬時表達，發(fā)現(xiàn)它們的功能類似于與之結(jié)構(gòu)相似的玉米P蛋白，它們都具有相似的靶基因特異性，調(diào)控一系列黃酮類物質(zhì)生物合成基因的表達［26］。而且這些體內(nèi)被激活的基因的啟動子區(qū)都存在MYB蛋白的識別元件。

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)結(jié)合全基因組芯片技術(shù)(ChIP-chip)或高通量信號測序技術(shù)(ChIP-seq)能夠檢測感興趣蛋白質(zhì)靶DNA的異常，在體內(nèi)的新的靶標DNA序列，從而產(chǎn)生更具有生物學意義的結(jié)果［27］。ChIP-chip或ChIP-seq已經(jīng)被證明是確定在染色質(zhì)水平序列的特異性轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)DNA結(jié)合位點的有力工具，從而避免了前面提到的需要很多附加說明的技術(shù)方法。近年來，應(yīng)用ChIP技術(shù)鑒定出了一些MYB蛋白在體內(nèi)的DNA結(jié)合位點。在植物中，應(yīng)用ChIP-chip技術(shù)鑒定出擬南芥兩個R2R3-MYB蛋白的體內(nèi)DNA結(jié)合位點，這兩個 MYB蛋白為 FOURLIPS(FLP;AtMYB124)和AtMYB88，它們可以直接結(jié)合到細胞周期相關(guān)基因的啟動子上［28］。ChIP-chip和ChIP-seq技術(shù)是目前確定一個轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)真正靶標位點最有效的方法，但是它需要有轉(zhuǎn)錄因子蛋白的抗體才能操作，這限制了它在MYB超家族研究中的應(yīng)用。

5 結(jié)論

MYB類轉(zhuǎn)錄因子屬于一大類植物轉(zhuǎn)錄因子，在植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控和對非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本實驗室中，通過細菌群體感應(yīng)信號分子AHLs處理野生型擬南芥，發(fā)現(xiàn)MYB44基因表達量有所上調(diào)，處理TDNA插入基因突變體atmyb44植株，MYB44下游的一些基因表達量下調(diào)，可以預(yù)測MYB44參與植物感應(yīng)細菌群體感應(yīng)信號(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。

過去的幾十年中我們對于特定序列的轉(zhuǎn)錄因子和它們靶目標DNA之間的分子間相互作用的理解已經(jīng)取得不凡的進展，并且更加具體的了解了MYB蛋白和它們的DNA結(jié)合位點之間的關(guān)系。然而人們對植物R2R3-MYB蛋白質(zhì)與其靶標DNA之間的相互作用的分子機制的理解還很不完整，只有某些特定植物中的少量的MYB蛋白與DNA的相互作用的特性在分子水平上得到描述。因此，嚴格的說在植物R2R3-MYB蛋白調(diào)控基因表達從而引起植物表型變化方面的研究還在初期階段。隨著更快速、精確和高通量研究蛋白-DNA間相互作用的新技術(shù)的出現(xiàn)，新的植物MYB蛋白與DNA相互作用的特性將會加速分析出來?；诖?，在未來十年內(nèi)有望在將蛋白超家族成員的分子信息轉(zhuǎn)換成整個生物體的應(yīng)答信息方面為我們提供更加深刻的理解。

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