黃麗君，張洪斌，胡雪芹

(合肥工業(yè)大學(xué)制藥工程系，合肥230009)

雄烯二酮(androstenedione)是甾體激素類(lèi)藥物的重要中間體［1］，對(duì)機(jī)體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，目前主要通過(guò)微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈所得。微生物法制取雄烯二酮具有產(chǎn)品純度高，不受原材料限制，易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［2，3］，但是也普遍存在底物植物甾醇在水相中溶解度小，菌種轉(zhuǎn)化能力低等缺點(diǎn)。

為了選育發(fā)酵性能優(yōu)良菌種，本文研究采用新型的N+注入法與NTG法對(duì)分枝桿菌進(jìn)行聯(lián)合誘變，以選育優(yōu)良的雄烯二酮高產(chǎn)菌株。

亞硝基胍(NTG)是一種高效的化學(xué)誘變劑，在適當(dāng)?shù)臈l件下，菌體的死亡率低而誘變率高，對(duì)每一細(xì)胞可以誘發(fā)一次至多次突變，因此有超誘變劑之稱(chēng)［4］。離子注入是20世紀(jì)80年代興起的一種材料表面處理技術(shù)。中國(guó)科學(xué)家獨(dú)辟蹊徑，將離子注入這一高新技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)作物品種改良并獲得成功，由此開(kāi)始了注入離子與生物體系相互作用過(guò)程的探索［5，6］，目前廣泛應(yīng)用于生物誘變育種中。利用低能離子注入具有生理?yè)p失小、突變范圍廣、突變程度高的特點(diǎn)，希望能夠篩選到高產(chǎn)突變菌株［7］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來(lái)源

分枝桿菌(Mycobacterium sp.)，由本實(shí)驗(yàn)保藏。

1.1.2 試劑和儀器

植物甾醇和雄烯二酮(購(gòu)于湖北遠(yuǎn)成藥業(yè));其他試劑均為分析純，水為去離子水。SPX-250型生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);島津GC-2014氣相色譜儀(日本島津);HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);HQL300B恒溫?fù)u床(武漢中科科學(xué)儀器廠)。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基3.75%，甘油2.0%，pH值7.2。

篩選培養(yǎng)基:植物甾醇1%，硝酸鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸鎂 0.05%，氯化鈉 0.05%，硫酸亞鐵0.001%，瓊脂2%，pH值7.2。

種子培養(yǎng)基:BPD復(fù)合酵母膏1.5%，葡萄糖0.6%，磷酸氫二銨0.06%，硝酸鈉0.54%，pH值7.2。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:有機(jī)相為大豆油10%，植物甾醇1%，水相為紅糖1.5%，麥芽糖1.08%，磷酸氫二銨0.06%，硝酸鈉0.54%，pH值7.2。

1.1.4 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基:溫度30℃ ～32℃，生長(zhǎng)周期5～7 d。

種子培養(yǎng)基:溫度30℃ ～32℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，生長(zhǎng)周期60 h。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:溫度30℃ ～32℃，接種量10%，轉(zhuǎn)速250 r/min，發(fā)酵周期 7 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備

挑取1環(huán)斜面培養(yǎng)基上已活化好的菌株，接入滅菌的、裝有玻璃珠的三角瓶中，置于31℃，250 r/min的恒溫?fù)u床中震蕩30 min，獲得菌懸液，并將其稀釋至細(xì)胞濃度約為107～108個(gè)/mL左右，備用。

1.2.2 NTG誘變方法

NTG配制:NTG結(jié)晶50 mg，加助溶劑丙酮1 mL溶解，用pH值6.0的磷酸鹽緩沖液配制成2.5 mg/mL原液。

誘變處理:取0.8 mL菌懸液，按 NTG終濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 依次加入NTG 原液，用緩沖液補(bǔ)至1 mL，對(duì)照只加緩沖液，31℃水浴處理30 min，用生理鹽水稀釋以終止反應(yīng)，涂皿分離。統(tǒng)計(jì)單菌落個(gè)數(shù)并計(jì)算致死率。

1.2.3 N+注入誘變

選擇經(jīng)NTG誘變后產(chǎn)率最高的突變株作為出發(fā)菌株，制備菌懸液。取5 mL適量稀釋后的菌懸液和5 mL 30%的甘油混合，搖勻后取0.1 mL均勻涂布于無(wú)菌平皿中，由無(wú)菌風(fēng)吹干后進(jìn)行N+注入，以經(jīng)過(guò)真空處理而不注入離子束的菌株作為對(duì)照。該工作在中國(guó)科學(xué)院合肥分院離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，選擇注入能量為10keV，注入劑量為(20～80)×1011ions/cm2，靶室真空度為10-3Pa。N+注入完畢后，用1 mL無(wú)菌水反復(fù)沖洗平板上的菌膜使其混合均勻，然后移取0.1 mL于篩選固體培養(yǎng)基中，31℃倒置培養(yǎng)5～7d，統(tǒng)計(jì)單菌落個(gè)數(shù)并計(jì)算致死率。

1.2.4 平板初篩方法

篩選培養(yǎng)基是由無(wú)機(jī)培養(yǎng)基添加1%的植物甾醇制成的，除了植物甾醇幾乎不含有任何碳源成分，因此只有能夠利用植物甾醇的菌株才能在平板中正常生長(zhǎng)。將誘變后的菌懸液各取0.1 mL均勻涂布于篩選培養(yǎng)基中，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的突變株用于下一級(jí)篩選。

1.2.5 搖瓶復(fù)篩方法

將初篩出來(lái)的菌株逐一接種至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 h后以10%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，31℃，250 r/min恒溫培養(yǎng)7 d。利用薄層色譜法初步判斷轉(zhuǎn)化情況，氣相色譜內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確測(cè)定產(chǎn)率，來(lái)驗(yàn)證菌體的轉(zhuǎn)化能力。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為了檢測(cè)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，將復(fù)篩所得到的高產(chǎn)突變株每7 d傳代1次，連續(xù)7代，搖瓶發(fā)酵測(cè)定產(chǎn)率。

1.3 發(fā)酵條件研究

發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH 值分別調(diào)為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，接種量為10%，于31℃、250 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d后測(cè)定產(chǎn)率。

確定最佳pH值后，向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接種6%、8%、10%、12%、14%、16%的種子液，于 31℃、250 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d后測(cè)定產(chǎn)率。

確定最佳pH值和接種量后，調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速分別為180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min、260 r/min、280 r/min，于31℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d后測(cè)定產(chǎn)率。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 薄層色譜法(TLC)定性分析

用乙酸乙酯以2：1的比例充分萃取發(fā)酵液，9000 r/min離心10 min。取上清液，用定量毛細(xì)管取樣5 μL，點(diǎn)于高效G硅膠板。以乙酸乙酯：石油醚=3：7為展開(kāi)劑展開(kāi)。展層結(jié)束后自然風(fēng)干薄板，用10%H2SO4為顯色劑噴涂，100℃下加熱顯色至明顯，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)(見(jiàn)圖1)。

圖1 薄層層析分析圖Fig 1 TLC analysis

1.4.2 氣相色譜內(nèi)標(biāo)法(GC)定量檢測(cè)

島津GC-2014氣相色譜系統(tǒng):色譜柱為REX-5不銹鋼柱;載氣為N2;載氣流速為1 mL/min;進(jìn)樣口溫度為300℃，柱溫300℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度為280℃。含量采用內(nèi)標(biāo)法［8］計(jì)算，內(nèi)標(biāo)物為膽固醇。

相對(duì)校正因子的計(jì)算:準(zhǔn)確稱(chēng)量相同摩爾量的膽固醇的雄烯二酮標(biāo)準(zhǔn)品，溶于乙酸乙酯中，用20 mL容量瓶定量。進(jìn)樣得測(cè)量結(jié)果，計(jì)算出相對(duì)校正因子。

經(jīng)計(jì)算得出相對(duì)校正因子為1.313。

樣品制備:將反應(yīng)結(jié)束后的發(fā)酵液，用2倍體積的乙酸乙酯充分萃取，然后將萃取液旋蒸至少于20 mL，用20 mL容量瓶定量，準(zhǔn)確加入與理論產(chǎn)值相同摩爾量的膽固醇標(biāo)品，進(jìn)樣得測(cè)量結(jié)果，計(jì)算產(chǎn)品產(chǎn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變及篩選結(jié)果

2.1.1 NTG誘變結(jié)果

統(tǒng)計(jì)各劑量組生成的單菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算不同劑量組的致死率，并每組隨機(jī)挑選一定數(shù)量長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落，以出發(fā)菌株為對(duì)照，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵篩選后，得到不同劑量組下的正突變率(高于出發(fā)菌株5%以上)。NTG濃度對(duì)雄烯二酮產(chǎn)生菌誘變效果的影響見(jiàn)表1。

表1 NTG誘變處理的致死率和正突變率Table 1 The positive lethal rate and mutant rate after NTG mutation

從表1可以看出，致死率隨著NTG濃度的增加而提高，正突變率先隨著誘變菌株死亡率的增加而提高，又后逐漸降低，在NTG濃度為0.6 mg/mL時(shí)，正向突變率最大，此時(shí)致死率為75.2%。現(xiàn)代育種理論認(rèn)為，誘變的微生物致死率在70%～75%時(shí)，能夠得到較好的誘變效果，負(fù)突變率較低，能得到大量的正突變菌株。因此確定NTG誘變時(shí)的最佳濃度為0.6 mg/mL。

在此基礎(chǔ)上對(duì)原始菌株進(jìn)行多次誘變，共篩選出100株長(zhǎng)勢(shì)良好的突變菌株，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定產(chǎn)物產(chǎn)率。結(jié)果表明，這100株突變菌株中產(chǎn)率明顯提高的有3株，產(chǎn)率分別為65.5%、60.4%、61.9%。將其中產(chǎn)率最高的突變株連續(xù)傳代7次，產(chǎn)率基本保持不變，證明其遺傳穩(wěn)定性良好，將其編號(hào)為Mycobacterium sp.N-1，作為N+注入誘變的出發(fā)菌株。

2.1.2 N+注入誘變

以NTG誘變后得到的最高產(chǎn)菌株Mycobacterium sp.N-1為出發(fā)菌株，進(jìn)行N+注入誘變。N+注入劑量對(duì)雄烯二酮產(chǎn)生菌誘變效果的影響見(jiàn)表2。

表2 N+注入誘變處理后的致死率和正突變率Table 2 The positive lethal rate and mutant rate after N+implantation mutation

從表2可以看出，隨著N+注入劑量的增加，菌株死亡率也逐漸增加，當(dāng)離子劑量為60×1011ions/cm2時(shí)，致死率達(dá)到75.2%。因此根據(jù)現(xiàn)代育種理論選擇離子強(qiáng)度10keV，離子劑量60×1011ions/cm2作為該菌株的最佳離子注入?yún)?shù)。

在此基礎(chǔ)上對(duì)菌株Mycobacterium sp.N-1進(jìn)行多次誘變，共篩選出100株長(zhǎng)勢(shì)良好的突變菌株，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定產(chǎn)物產(chǎn)率。這100株突變菌株中產(chǎn)率明顯提高的有3株，產(chǎn)率分別為86.5%、83.9%、82.0%。將產(chǎn)率最高的突變株編號(hào)為Mycobacterium sp.N-2，進(jìn)行連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)。

2.2 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對(duì)得到的高產(chǎn)菌株N-2進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性考察。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程:高產(chǎn)菌株單菌落→種子培養(yǎng)基→搖瓶發(fā)酵測(cè)雄烯二酮產(chǎn)率，結(jié)果如表3所示。連續(xù)傳代7次后產(chǎn)率比較穩(wěn)定，可見(jiàn)菌株N-2是一株穩(wěn)定高產(chǎn)的雄烯二酮產(chǎn)生菌。

表3 突變株N-2的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The experimental results of genetic stability for mutation strain N-2

2.3 誘變效果

挑選經(jīng)N+注入誘變后性狀大、長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在注入劑量為60×1011ions/cm2的實(shí)驗(yàn)組中篩選得到高產(chǎn)突變株Mycobacterium sp.N-2，其產(chǎn)率與原始菌株相比提高了37.8%。圖2為突變株N-2轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的GC圖譜，可見(jiàn)雄烯二酮出峰時(shí)間在8.9 min左右，膽固醇出峰時(shí)間在17.9 min左右。另外底物植物甾醇轉(zhuǎn)化完全，且?guī)缀鯚o(wú)副產(chǎn)物生成，這對(duì)后續(xù)純化工藝非常有利。而原始菌株在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)并不能將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化完全，并且隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng)，副產(chǎn)物的量也隨之增加。

圖2 突變株N-2轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的GC圖譜Fig 2 GC chromatograms of mutation strain N-2 bioconversion

2.4 發(fā)酵條件研究結(jié)果

2.4.1 初始pH值對(duì)發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基的pH值對(duì)微生物的生命活動(dòng)有著很大的影響，主要是對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響。菌體內(nèi)含有的酶均有其最適pH值，pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使其活性降低，甚至有可能導(dǎo)致酶徹底失活而使轉(zhuǎn)化不能進(jìn)行。分別考察pH值6.5、7.0、7.5、8.0、8.5時(shí)對(duì)誘變菌株發(fā)酵過(guò)程的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。從圖中可知，pH值對(duì)菌株轉(zhuǎn)化能力有較大影響，初始pH值為7.5時(shí)最有利于生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化。

圖3 初始pH值對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig 3 Effect of initial pH on fermentation process

2.4.2 接種量對(duì)發(fā)酵的影響

適當(dāng)?shù)慕臃N量是正常發(fā)酵的關(guān)鍵因素。分別考察接種量為6%、8%、10%、12%、14%、16%時(shí)對(duì)菌株發(fā)酵過(guò)程的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。從圖中可知，菌株的最適接種量為12%。接種量低于12%，菌體生長(zhǎng)較慢，發(fā)酵周期長(zhǎng)，在相同的時(shí)間內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)率低。接種量高于12%時(shí)菌體雖然生長(zhǎng)過(guò)快，但是過(guò)快的菌體生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和溶氧不足，菌體容易衰老和自溶，反而不利于產(chǎn)物的生物合成。

圖4 接種量對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig 4 Effect of incubation volume on fermentation process

2.4.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響

搖床轉(zhuǎn)速的大小能夠影響到培養(yǎng)基中通氣量的多少，而分枝桿菌是好氧菌，若供氧不足會(huì)影響微生物的生理代謝和產(chǎn)物生成量。分別考察搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min、260 r/min、280 r/min 時(shí)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。從圖中可知，隨著轉(zhuǎn)速的不斷增加，菌株降解底物的能力也不斷增加。最終確定最適搖床轉(zhuǎn)速為260 r/min，此時(shí)產(chǎn)率最高。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig 5 Effect of rotating speed on fermentation process

3 結(jié)論

目前，雄烯二酮的研究?jī)?nèi)容集中在尋找新的產(chǎn)雄烯二酮菌株［9］或通過(guò)基因工程手段對(duì)菌株進(jìn)行分子改造［10］，或者采用不同的誘變技術(shù)進(jìn)行選育［11］。Olga V Egorova等人利用菌株對(duì)抑菌劑的耐受性篩選出一株突變菌株Mycobacterium sp.VKM Ac-1815D，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，將其產(chǎn)率提高到 70%左右［12］。Vrushali Gulla等人［13］利用UV、NTG、絲裂霉素等方法對(duì)一株偶發(fā)分枝桿菌進(jìn)行誘變選育，得到高產(chǎn)菌株Mycobacterium fortuitum subsp.fortuitum NCIM 5239，產(chǎn)率能達(dá)到71.3%。本研究采用NTG法與新型誘變育種手段低能N+注入聯(lián)合誘變選育雄烯二酮高產(chǎn)菌株，其中N+注入誘變?cè)诜种U菌選育中首次應(yīng)用，并取得了很好的效果，篩選到一株比原始菌株產(chǎn)率提高了將近37.8%的高產(chǎn)突變株Mycobacterium sp.N-2，且遺傳性狀較為穩(wěn)定。同時(shí)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定高產(chǎn)突變菌株的最佳發(fā)酵條件為初始pH值7.5，接種量12%，搖床轉(zhuǎn)速260 r/min。實(shí)驗(yàn)證實(shí)這兩種誘變方法聯(lián)合應(yīng)用在分枝桿菌的育種中是切實(shí)可行的。

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