關(guān)曉慧 王 君 郭 菲 周 杰 王寶利

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中除了造血干細(xì)胞之外的另一類干細(xì)胞，具有定向或多向分化的潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下可以向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等組織細(xì)胞分化。正常生理狀態(tài)下，間充質(zhì)干細(xì)胞具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞相等的分化潛能。在某些病理狀態(tài)下，成骨或成脂的某一方面調(diào)控占優(yōu)勢，通常會削弱間充質(zhì)干細(xì)胞向另一方向分化的能力，存在著此消彼長的關(guān)系[1-2]。1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]是體內(nèi)主要的鈣磷調(diào)節(jié)激素，其可通過調(diào)節(jié)腸道和腎臟對鈣磷的吸收和重吸收、骨鈣的轉(zhuǎn)移來調(diào)控礦物質(zhì)的生理平衡，促進(jìn)骨的礦化和生長[3]。此外，生理劑量的1,25(OH)2D3可抑制成骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[4-5]。本研究觀察了1,25(OH)2D3對脂肪細(xì)胞分化的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2由本室保存。1,25(OH)2D3、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）、地塞米松和胰島素購自Sigma；胎牛血清、BME、胰酶、α-MEM等為Invitrogen公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、蛋白提取試劑盒為天根公司產(chǎn)品；β連環(huán)素（β-catenin）抗體購自Epitomics公司；引物由上海Invit?rogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 前脂肪細(xì)胞C3H10T1/2的培養(yǎng)與分化 在37℃、5%CO2的條件下，用含10%FBS和100 U/mL青霉素、鏈霉素的BME培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%匯合時，將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合1 d后，加入含有0.5 mmol/L IBMX、10-7mol/L地塞米松、10 mg/L胰島素和10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，再換以含10 mg/L胰島素、10%FBS的α-MEM培養(yǎng)48 h。

1.2.2 細(xì)胞的分組與處理 C3H10T1/2細(xì)胞分為6組（每組4孔），分別為對照組、誘導(dǎo)分化組和4個不同劑量(依次為10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的1,25(OH)2D3處理組（依次命名為VD3處理組1～4）。其中對照組加入溶媒，誘導(dǎo)分化組加入脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑進(jìn)行誘導(dǎo)分化（如1.2.1所述），1,25(OH)2D3處理組除了加入脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑外，分別予以10-9、10-8、10-7、10-6mol/L 1,25(OH)2D3處理。

1.2.3 油紅O染色以及細(xì)胞計數(shù)觀察脂肪細(xì)胞的分化情況 將誘導(dǎo)5 d的細(xì)胞用PBS洗滌后，依次用4%多聚甲醛固定15 min；蒸餾水漂洗1 min；60%異丙醇孵育1～2 min；油紅O染色5 min；蒸餾水漂洗干凈。顯微鏡下觀察各組脂肪細(xì)胞的分化情況，拍照并計數(shù)；然后計算成脂率（脂肪細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）及RF（處理組成脂率/對照組成脂率），分析脂肪細(xì)胞的分化情況。

1.2.4 RT-PCR檢測脂肪細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子和表征基因表達(dá) 細(xì)胞總RNA提取按照天根總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。采用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA合成為cDNA第1鏈。運用primer 5軟件設(shè)計脂肪細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ、CCAAT增強子結(jié)合蛋白（C/EBP）α、脂肪細(xì)胞表征因子aP2以及Wnt/β-catenin信號通路抑制因子分泌性卷曲相關(guān)蛋白1（sFRP1）的引物，引物序列見表1。RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Sybr Green PCR Master Mix 10 μL，去離子水補充至20 μL。反應(yīng)條件：95℃2 min預(yù)變性，95℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸20 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。采用融解曲線法分析PCR產(chǎn)物，以排除引物二聚體的干擾。采用2-??Ct法計算各實驗組目的基因相對于對照組的表達(dá)量，其中?Ct=目的基因Ct值-β-actin Ct值。

1.2.5 Western blot檢測β-catenin蛋白表達(dá) 消化收集細(xì)胞，加入適量蛋白裂解液，冰上放置20 min，10 000×g離心15 min，取上清，用BCA方法測定蛋白濃度。分別取各組蛋白30 μg進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，脫脂奶粉封閉2 h，與一抗孵育過夜，TBST洗滌4次，每次10 min后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，TBST洗滌4次，每次10 min后，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測印跡結(jié)果。

Table 1 Primer sequence of genes表1 各基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1,25(OH)2D3對脂肪細(xì)胞分化的影響 對照組前脂肪細(xì)胞只有6.00%分化成脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)分化組可見80.15%的細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞；1,25(OH)2D3處理后，分化的脂肪細(xì)胞顯著減少（均Plt;0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，見表2。

Table 2 Comparison of adipocyte differentiation between different treated cells表2 各組細(xì)胞中脂肪細(xì)胞分化率的比較（n=6，x±s）

2.2 RT-PCR檢測目的基因表達(dá) 與對照組比較，誘導(dǎo)分化組脂肪細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBPα及脂肪細(xì)胞表征因子aP2的mRNA表達(dá)顯著增加，分別達(dá)到對照組的11.69倍、11.44倍和28.18倍，Wnt/βcatenin信號通路抑制因子sFRP1 mRNA亦顯著增加，達(dá)到對照組的4.52倍（均Plt;0.01）。1,25(OH)2D3處理后PPARγ、C/EBPα、aP2和sFRP1mRNA表達(dá)顯著減少，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，見表3。

Table 3 Relative expression levels of PPARγ,C/EBPα,aP2 and sFRP1 mRNA in different groups of cells表3 各組細(xì)胞中PPARγ、C/EBPα、aP2和sFRP1 mRNA相對表達(dá)情況 （n=6，x±s）

2.3 Western blot檢測β-catenin蛋白的表達(dá) 對照組、誘導(dǎo)分化組、1,25(OH)2D3處理組（10-6mol/L組）中β-catenin/β-actin比值依次為0.98±0.07、0.48±0.04、0.83±0.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=87.61，Plt;0.01）。與對照組比較，誘導(dǎo)分化組β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著下降（Plt;0.01）；1,25(OH)2D3處理后，β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.01），見圖1。

Figure 1 Effects of 1,25(OH)2D3on β-catenin protein expression in C3H10T1/2圖1 1,25(OH)2D3對C3H10T1/2中β-catenin蛋白表達(dá)的影響

3 討論

脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞來源于相同的祖細(xì)胞-間充質(zhì)干細(xì)胞，因而脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化之間存在著此消彼長的關(guān)系。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中C/EBPs和PPARγ等轉(zhuǎn)錄因子起了關(guān)鍵性作用，其中PPARγ的作用尤為顯著[6]。C/EBPs家族屬于脂肪細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，包括α、β、δ3種異構(gòu)體，它們分別在脂肪細(xì)胞分化的不同時期表達(dá)[7]。其中，C/EBP β和 C/EBP δ在前脂肪細(xì)胞分化早期表達(dá)較高，可以誘導(dǎo)C/EBPα和PPARγ的表達(dá)（PPARγ和C/EBPα的啟動子上均含有C/EBP的結(jié)合位點），到分化晚期C/EBP β表達(dá)降低而C/EBP δ幾乎不表達(dá)，C/EBP α在分化晚期開始表達(dá)，它可以轉(zhuǎn)錄激活許多脂肪細(xì)胞特異性基因如aP2，從而進(jìn)一步促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化。PPARγ是一類由配體激活的脂肪細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核激素受體超家族，在決定細(xì)胞命運、脂類物質(zhì)生物合成、炎癥和胰島素敏感性等方面有重要功能[8]。間充質(zhì)細(xì)胞中PPARγ被激活后可以抑制Runx2和Osterix等成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，因而成骨細(xì)胞分化減弱而脂肪細(xì)胞分化加強。相反，PPARγ2基因失活突變也可以打破骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨/成脂分化的平衡，造成脂肪細(xì)胞分化障礙而成骨細(xì)胞分化增強，小梁骨量增加[9]。

1,25(OH)2D3是維生素D在體內(nèi)的最終活性成分，其在調(diào)控骨形成以及骨發(fā)育中起重要作用。Boyan等[4]研究發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3處理成骨細(xì)胞分化時，成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix等表達(dá)增加，成骨細(xì)胞分化增強。與此同時，成骨細(xì)胞的增殖受到抑制。

本研究中，受脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑的影響，間充質(zhì)細(xì)胞中PPARγ和C/EBPα表達(dá)量急劇增加，脂肪細(xì)胞表征因子aP2也顯著升高。1,25(OH)2D3處理后PPARγ、C/EBPα及aP2的mRNA表達(dá)顯著減少。與此一致，在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑的作用下，間充質(zhì)細(xì)胞分化為具有大量脂肪滴的脂肪細(xì)胞，而1,25(OH)2D3的處理強烈阻斷脂肪細(xì)胞的生成。

經(jīng)典Wnt通路通過上調(diào)成骨分化相關(guān)基因Runx2、DIx5或Osterix促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育為成骨細(xì)胞，而成脂細(xì)胞的活化需要經(jīng)典的Wnt信號通路的失活[10-11]。本研究中1,25(OH)2D3下調(diào)C3H10T1/2細(xì)胞中sFRP1 mRNA的表達(dá)，而β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明1,25(OH)2D3可能通過下調(diào)sFRP1基因表達(dá)，繼而激活β-catenin信號通路，從而阻斷脂肪細(xì)胞分化。

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