唐秋莎 陳道楨 臧 嘉 郭彩琴

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌[1]。目前，卵巢癌的治療以手術為主，并聯(lián)合化療與放療。晚期卵巢癌治療后常易復發(fā)，一旦復發(fā)，治療極為困難，5年存活率一般只能達到20%～30%[2]。所以，積極探索新的治療藥物和方法具有十分重要的意義[3-5]。本研究在前期工作基礎上[6]，觀察核素標記葉酸靶向白蛋白納米微球(188Re-folate-CDDP/HAS MNP)對人卵巢癌細胞SKOV3體內生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器188Re-folate-CDDP/HAS MNP[7]、四氧化三鐵納米磁粒由本室自制[8]；小牛血清、McCOY’s 5A培養(yǎng)基、葉酸(Sigma)，注射用順鉑(山東齊魯制藥有限公司)，人血清白蛋白(上海生工生物科技有限公司)。188W/188Re發(fā)生器（上海科新公司），SPG-06A高頻感應加熱設備：頻率230 kHz，功率4 kW，輸出交變加熱電流5～30 A（深圳雙平高頻加熱器廠）。

1.2 實驗動物 SPF級BALB/C裸鼠64只，雌性，4周齡，體質量18～22 g，購自中科院上海實驗動物中心，許可證號：SCXK（滬）2002-0010。

1.3 方法

1.3.1 SKOV3人卵巢癌細胞培養(yǎng) SKOV3人卵巢癌細胞接種于含10%小牛血清的McCOY’s 5A培養(yǎng)液中，在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，實驗時取對數(shù)生長期細胞。

1.3.2188Re-folate-CDDP/HAS MNP對SKOV3人卵巢癌細胞移植瘤生長的抑制作用 （1）裸鼠卵巢癌移植瘤模型的建立：將Balb/c nu/nu荷人SKOV3瘤株裸小鼠頸椎脫臼處死，浸入75%乙醇1 min，無菌條件下取出腫瘤，剝除表面纖維包膜，將腫瘤切為1 mm3的瘤塊，浸入4℃生理鹽水備用。Balb/c nu/nu裸小鼠乙醚麻醉后消毒右肩背皮膚，用12號注射針頭穿破皮膚，將瘤塊吸入14號上頜竇穿刺針通過皮下隧道種植在右肩胛部皮下，用絡合碘棉球加壓消毒穿刺處皮膚。待小鼠清醒后放入另一消毒飼養(yǎng)盒內。（2）建瘤成功的荷瘤鼠實驗分組及治療：接種瘤塊7 d后，即可觀察到腫瘤在小鼠皮下膨脹性生長，30～35 d后，移植瘤長徑即可達0.5 cm左右。除去腫瘤生長過快和過慢的荷瘤鼠，將64只腫瘤長至0.5 cm的荷瘤鼠隨機分為8組，每組8只。（A）陰性對照組：注入0.1 mL1640培養(yǎng)液。（B）單純化療組：folate-CDDP/HAS MNP，不加磁場。（C）單純放療組：188Re-folate-HAS MNP，不加磁場。（D）單純熱療組：folate-HAS MNP，加磁場。（E）化療聯(lián)合放療組：188Re-folate-CDDP/HAS MNP，不加磁場。（F）化療聯(lián)合熱療治療組：folate-CDDP/HAS MNP，加磁場。(G)放療聯(lián)合熱療治療組：188Re-folate-HAS MNP，加磁場。(H)熱療、化療、放療聯(lián)合治療組：0.1 mL188Re-folate-CDDP/HAS MNP,加磁場。白蛋白納米球濃度為20 mg/kg，約含CDDP 3 mg/kg，放射性強度約為22.2 MBq。注射上述藥物處理24 h后，將D、F、G、H4組移入交變磁場，0.5%的戊巴比妥鈉溶液60 mg/kg腹腔注射，待完全麻醉后置高頻感應加熱器下照射（接種部位位于板式線圈中央）。經(jīng)確認腫瘤中心與磁場中心重疊。在交變磁場下加熱30 min。相同方法共熱療3次，間隔時間為48 h。治療時測量治療區(qū)和其周圍區(qū)域的溫度變化情況。（3）腫瘤質量抑制率：從熱療后的第2天開始觀察各組荷瘤鼠及腫瘤的生長情況并分別予以記錄和拍照，至治療周期結束(6周)后，用脫臼法處死荷瘤鼠并剝離出腫瘤，用電子天平稱瘤質量，依公式計算腫瘤質量抑制率（%）=(1-實驗組腫瘤質量/對照組腫瘤質量)×100%。（4）大體形態(tài)及病理組織學觀察：在治療過程中觀察各組腫瘤表面的皮膚改變，治療結束后取出各組腫瘤，觀察外觀大小、顏色、形態(tài)，取各組全部腫瘤組織、心、肝、脾、腎、肺等，經(jīng)4%中性甲醛固定、取材、脫水、透明、石蠟包埋、切片脫蠟、HE染色、封片，光鏡下形態(tài)學觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法 用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)采用x±s表示，行t檢驗和單因素方差分析，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤質量抑制率 各治療組的腫瘤質量均低于對照組（Plt;0.05），熱療、化療、放療聯(lián)合治療組的腫瘤質量低于其他治療組（Plt;0.05），見表1。

Table 1 Comparison of the quality and inhibitory rate of tumor between eight groups表1 各組腫瘤質量及抑制率比較

2.2 大體形態(tài)改變 在整個治療過程中，熱療組腫瘤表面的皮膚時有出血、壞死及焦痂形成，有的焦痂可脫落，而對照組及未加熱組少見此種改變；在治療周期結束后，取出各組腫瘤組織發(fā)現(xiàn)加材料熱療組腫瘤均呈黑褐色及灰白色相間外觀、病理證實為注入的納米磁性粒子，對照組腫瘤呈灰白色、顏色較均勻一致；對照組腫瘤隨著治療時間的延長而逐漸增大，表面光滑，未見出血壞死，治療組腫瘤在整個治療周期中逐漸減小，部分表面凹凸不平，時有出血壞死。

2.3 病理組織學改變 光學顯微鏡組織學檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤組織為低分化癌；熱療、化療、放療聯(lián)合治療組部分腫瘤組織明顯出血、壞死，其間可見黑色磁性納米粒沉積，部分腫瘤組織正常，在二者交界處有炎癥反應帶及淋巴細胞浸潤，而對照組腫瘤組織壞死較輕、炎癥反應及淋巴細胞浸潤也不明顯，見圖1、2。

3 討論

近年來，以葉酸介導藥物靶向腫瘤細胞的研究逐漸成為熱點[9]。本文采用包裹化療藥物(順鉑)、磁粒的白蛋白納米微球，并在其表面偶聯(lián)葉酸及標記放射性核素188Re[7]，利用葉酸受體在腫瘤細胞表面高表達的特點[10]，對腫瘤細胞實現(xiàn)靶向性的熱療、化療、放療三重殺傷作用。

在體內治療實驗中，首先需制備移植瘤模型。由于卵巢癌的生理特點，未見卵巢癌原位動物模型的報道，故本文采用在小鼠腋下接種SKOV3腫瘤細胞的異位移植瘤模型。在SKOV3建立異位卵巢癌的過程中發(fā)現(xiàn)，SKOV3細胞直接接種于裸鼠皮下潛伏期長，約7 d左右可見開始生長，25 d后生長較快，但長勢不太均勻。故本實驗先將SKOV3細胞于裸鼠皮下接種，待瘤塊長至合適大小后，超凈臺上無菌環(huán)境下，處死裸鼠，剝取瘤塊，分割成大小均勻的小塊，再用穿刺針穿刺注入裸鼠皮下，10 d以后，可見腫瘤長勢良好。這樣可減少組間腫瘤本身大小差異對藥效評價的影響。

近年來，腫瘤綜合治療的研究發(fā)展迅速，大量體內及體外實驗均證明熱療聯(lián)合放療、化療可以明顯增強彼此的治療效果。熱療可以抑制多重耐藥菌（MDR）1和多重耐藥相關基金(MRP)的表達從而對抗多藥耐藥性，增強細胞內藥物濃度[11]。熱療還可以大大增強癌細胞對放療的敏感性[12]，從而誘導細胞凋亡。但在聯(lián)合治療方式中，往往化療藥物和熱量缺乏靶向性，技術方面也很難達到控溫和恒溫的要求，本實驗以白蛋白磁性納米微球為載體，以葉酸受體為作用靶點，將化療、熱療、核素放療三者有機結合起來。特異性方面，利用葉酸受體配體高親合性的生物靶向性，以保證治療安全性[13]；在治療作用方面，結合化療及核輻射的定向殺傷作用和磁感應升溫的物理治療，以達到治療的有效性[14]，磁感應加熱的模式也在一定程度達到了控溫和恒溫的要求。本研究結果表明，各治療組的腫瘤質量均低于對照組，且與其他治療組相比，熱療、化療、放療聯(lián)合治療組對細胞增殖的抑制作用最為顯著。

本研究組織學檢查發(fā)現(xiàn)許多均一性棕黃色的磁性納米粒聚集在腫瘤周邊的基質中，該材料沉積部位附近多數(shù)腫瘤細胞消失，并且在材料周圍可見壞死區(qū)域。然而熱療過程中不可避免的技術難題是使腫瘤組織均勻升溫達到所需的溫度而不損傷腫瘤周圍正常組織。為了解決該難題，本研究采用了按順時針3、6、9、12點多點注射的方法將納米粒注入腫瘤瘤體內。結果顯示該方法對腫瘤周圍正常組織損傷小、升溫均勻、材料具有很好的彌散性。

Figure 1 Results of hematoxylin and eosin staining in transplanting human ovarian cancer after treatment with combined therapy of hyperthermia,chemotherapy and radiotherapy(×400)圖1 熱療、化療、放療聯(lián)合治療組移植性卵巢癌HE染色圖(×400)

Figure 2 Results of hematoxylin and eosin staining in transplanting human ovarian cancer of negative control group(×400)圖2 對照組裸鼠卵巢癌移植瘤HE染色圖(×400)

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