孫冬梅，譚志燦，畢曉黎，羅文匯（.廣東省中醫(yī)研究所，廣州50095；.廣州中醫(yī)藥大學，廣州50405）

布渣葉為椴樹科植物破布葉Microcos paniculata L.的干燥葉[1]，產(chǎn)于廣東、廣西、海南、云南等地，印度、印度尼西亞亦有分布；在我國，尤以兩廣地區(qū)資源豐富，其中廣東的陽西、湛江為主產(chǎn)地，均以野生為主。本品味微酸，性涼，無毒，具有清熱利濕、健胃消滯的功效，用于治療感冒發(fā)熱、黃疸、食欲不振、消化不良、脘腹脹痛、泄瀉、瘡瘍、蜈蚣咬傷等[2-4]。布渣葉的藥用歷史最早見于清·何克諫所著的嶺南本草書籍《生草藥性備要》，載曰：“味酸，性平，無毒，解一切蠱脹，清黃氣，消熱毒。作茶飲，去食積。又名布渣”。

布渣葉主要含有黃酮、生物堿、有機酸、揮發(fā)油、鞣質、酚類等成分[5-11]。其中的黃酮苷類具有多方面的生物活性，如抗脂質過氧化、抗衰老、清除自由基、降低血脂及血膽固醇、抗菌消炎、抗病毒、增強免疫功能等。牡荊苷和異牡荊苷是含量較高的黃酮碳苷，具有降血壓、止痙攣、抗感染、抗腫瘤、抗菌、輻射保護以及清除自由基的作用[12-15]，故可以作為布渣葉藥材的質量控制指標。牡荊苷和異牡荊苷分子中含有許多酚羥基，極性較大，并且是同分異構體，極性相似，不易分離。目前，采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定布渣葉中牡荊苷和異牡荊苷的研究未見報道，現(xiàn)行版《中國藥典》也僅以牡荊苷作為布渣葉含量測定的指標。因此，本試驗建立了布渣葉藥材中牡荊苷和異牡荊苷的HPLC含量測定方法，并對不同產(chǎn)地、不同采收期布渣葉中牡荊苷和異牡荊苷進行含量分析，為有效控制藥材質量及合理利用植物資源提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，含二極管陣列檢測器（DAD）、四元梯度泵、G2170 AA數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)（美國Agilent公司）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205 DU型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥材

布渣葉（樣品來源見表1），經(jīng)廣東省中醫(yī)研究所劉法錦教授鑒定為椴樹科植物破布葉M.paniculata L.的干燥葉。

表1 布渣葉樣品來源Tab 1 Sample source of M.paniculata

1.3 試劑

牡荊苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111687-200602）；異牡荊苷對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：Y-127-110705，純度≥98%）；甲醇為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO Capcell pak MG C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%甲酸溶液（30∶70，V/V）；檢測波長：339 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃。

2.2 對照品溶液的制備

取牡荊苷和異牡荊苷對照品各適量，精密稱定，加70%甲醇溶解并制成質量濃度分別為133.40、184.70μg/ml的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，稱定質量，超聲處理（功率：200 W，頻率：40 kHz）1 h，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關系考察

精密量取混合對照品溶液1、5、10、15、20、25ml，分別置25 ml量瓶中，加入70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得牡荊苷質量濃度分別為5.34、26.68、53.36、80.04、106.72、133.40μg/ml和異牡荊苷質量濃度分別為7.39、36.94、73.88、110.82、147.76、184.70μg/ml的系列溶液。精密吸取上述系列溶液各10 μl注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定。以峰面積積分值（y）為縱坐標，進樣量（x，ng）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y牡荊苷＝2.6418 x+3.0268（r＝0.9999，n＝6）、y異牡荊苷＝2.6962 x－5.1328（r＝0.9999，n＝6）。結果表明，牡荊苷和異牡荊苷的進樣量分別在53.40～1334.00、73.90～1847.00ng范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液（牡荊苷20.40μg/ml、異牡荊苷20.10μg/ml）10μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖。結果，牡荊苷和異牡荊苷峰面積的RSD分別為0.29%和0.47%（n均為6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液（S7）10μl，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積。結果，牡荊苷和異牡荊苷質量分數(shù)的RSD分別為0.41%和0.37%（n均為7），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批布渣葉樣品（S30）適量，共6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算樣品中牡荊苷和異牡荊苷的質量分數(shù)。結果，牡荊苷的平均質量分數(shù)為0.068%，RSD＝0.89%（n＝6）；異牡荊苷的平均質量分數(shù)為0.141%，RSD＝0.92%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取同一批已知質量分數(shù)（牡荊苷為0.068%，異牡荊苷為0.141%）的布渣葉樣品（S30）9份，每份約1.25 g，精密稱定，分別精密加入一定質量濃度的牡荊苷和異牡荊苷混合對照品溶液50 ml，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果分別見表2、表3。

表2 牡荊苷的加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test of vitexin（n＝9）

表3 異牡荊苷的加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 3 Results of recovery test of isovitexin（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取不同來源的布渣葉樣品適量，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件測定樣品中牡荊苷和異牡荊苷的質量分數(shù)，結果見表4；色譜見圖1。

表4 樣品含量測定結果Tab 4 Results of content determination of sample

3 討論

3.1 供試品溶液的制備

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

試驗比較了以50%、70%、100%甲醇及70%乙醇4種不同溶劑對布渣葉藥材進行超聲處理后所得牡荊苷和異牡荊苷的質量分數(shù)。結果表明，采用70%甲醇提取效果較好，而且能很好地減少布渣葉中葉綠素等雜質對色譜柱的污染。在此基礎上比較了回流提取和超聲處理的效率，結果顯示2種提取方法無顯著性差異，因此選擇操作較方便的超聲提取法。另外，比較了超聲時間和固液比對提取效果的影響，結果顯示超聲處理1 h、固液比為1∶20（m/V）時，牡荊苷和異牡荊苷基本能夠提取完全。

3.2 檢測波長的選擇

采用DAD進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)牡荊苷和異牡荊苷均在339 nm波長附近有最大吸收，因此選定339 nm為檢測波長。

3.3 流動相的選擇[16-19]

試驗比較了甲醇-甲酸、甲醇-乙酸、甲醇-磷酸3種流動相系統(tǒng)，以及不同的流動相比例，并考察了不同甲酸濃度對牡荊苷和異牡荊苷色譜行為的影響。結果表明，以甲醇-0.4%甲酸溶液（30∶70，V/V）作為流動相為佳，此時牡荊苷和異牡荊苷均能達到基線分離，且峰形對稱。

3.4 色譜柱的考察

試驗分別考察了不同廠家的色譜柱[Waters XbridgeTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SHISEIDO Capcell pak MG C18（250 mm×4.6mm，5μm）、Merck Hibar Purospher Star RP-18 e（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agela Venusil ASB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]對牡荊苷和異牡荊苷的分離效果。結果表明，在“2.1”項下色譜條件下，SHISEIDO Capcell pak MG C18（250mm×4.6mm，5μm）和Merck Hibar Purospher Star RP-18 e（250 mm×4.6 mm，5 μm）均能使牡荊苷和異牡荊苷色譜峰達到基線分離。由于采用Merck色譜柱時牡荊苷和異牡荊苷出峰時間延遲，因此選用SHISEIDO Capcell pak MG C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱。

3.5 質量分析

布渣葉中牡荊苷和異牡荊苷2種黃酮碳苷均具有較強的生物活性，因此以牡荊苷和異牡荊苷為指標，結合藥材的外觀性狀、產(chǎn)量及當?shù)刈匀画h(huán)境條件建立藥材的質量評價標準，對其進行質量控制與評價，更具科學性。

研究結果表明，布渣葉中牡荊苷質量分數(shù)較高的樣品，異牡荊苷的質量分數(shù)也相對較高；同一樣品的2種黃酮碳苷中，以異牡荊苷的質量分數(shù)較高。

不同產(chǎn)地布渣葉中2種黃酮碳苷的質量分數(shù)存在差異，其中以廣東陽西古井、肇慶鼎湖山和雷州等產(chǎn)地的布渣葉牡荊苷和異牡荊苷的質量分數(shù)較高，而廣東博羅等地的質量分數(shù)較低。市場流通的布渣葉飲片中牡荊苷質量分數(shù)最高可達到0.259%，最低為0.025%；異牡荊苷質量分數(shù)最高可達到0.421%，最低為0.054%，其中牡荊苷的質量分數(shù)大部分能達到現(xiàn)行《中國藥典》標準。影響2種黃酮碳苷質量分數(shù)的因素可能與藥材生長的環(huán)境（光照、氣候、土壤等）有關，同時藥材采收的時節(jié)、干燥的方法、貯藏和養(yǎng)護的條件等因素也可能對此有影響。

綜上，本方法重復性好、操作簡便、結果準確可靠，可為布渣葉的質量評價和資源利用提供試驗依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：88.

[2]廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東省中藥材標準：第一冊[S].廣州：廣東科技出版社，2004：66.

[3]江蘇新醫(yī)學院.中藥大詞典：下冊[M].上海：上海科學技術出版社，1986：1824.

[4]《中藥商品知識》編寫組.中藥商品知識：中冊[M].廣州：廣東科技出版社，1989：129.

[5]石玲艷.破布葉的化學鑒別方法[J].廣西中醫(yī)藥，1993，16（2）：40.

[6]曾聰彥，吳惠妃，郭展榮.布渣葉化學成分定性鑒別的實驗研究[J].世界中西醫(yī)結合雜志，2009，4（3）：175.

[7]羅集鵬.布渣葉黃酮類成分的研究[J].中草藥，1993，24（9）：455.

[8]Bandara KA，Kumar V，Jacobsson U，et al.Insecticidal piperidine alkaloid from Microcos paniculata stem bark[J].Phytochemistry，2000，54（1）：29.

[9]馮世秀，劉梅芳，魏孝義，等.布渣葉中三萜和黃酮類成分的研究[J].熱帶亞熱帶植物學報，2008，16（1）：51.

[10]畢和平，韓長日，王芳，等.破布葉葉片中揮發(fā)油的化學成分研究[J].林產(chǎn)化學與工業(yè)，2006，27（3）：124.

[11]羅集鵬，張麗萍，楊世林，等.布渣葉的生物堿類成分研究[J].藥學學報，2009，44（2）：150.

[12]Agnese AM，Pérez C，Cabrera JL.Adesmia aegiceras：antimicrobial activity and chemical study[J].Phytomedicine，2001，8（5）：389.

[13]Picerno P，Mencherini T，Lauro MR，et al.Phenolic constituents and antioxidant properties of Xanthosoma violaceum leaves[J].J Agric Food Chem，2003，51（22）：6423.

[14]Bramati L，Aquilano F，Pietta P.Unfermented rooibos tea：quantitative characterization of flavonoids by HPLCUV and determination of the total antioxidant activity[J].J Agric Food Chem，2003，51（25）：7472.

[15]Hien TV，Huong NB，Hung PM，et al.Radioprotective effects of vitexin for breast cancer patients undergoing radiotherapy with cobalt-60[J].Integr Cancer Ther，2002，1（1）：38.

[16]佟美鴻，劉威，付玉杰.HPLC法測定木豆中牡荊苷和異牡荊苷含量[J].林產(chǎn)化學與工業(yè)，2008，28（6）：34.

[17]李坤平，潘天玲，高崇凱.HPLC法測定布渣葉中牡荊苷和異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷的含量[J].藥物分析雜志，2010，30（9）：1746.

[18]筆雪艷，劉曉鳳，張清波.HPLC法測定清開靈泡騰片中梔子苷的含量[J].中國藥房，2011，22（3）：240.

[19]黃其春，涂文升.RP-HPLC法測定甘露扶正口服液中黃芩苷的含量[J].中國藥房，2011，22（3）：253.