孫慶文，王悅云，徐文芬，何順志，溫芳芳（貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，貴陽 550002）

“黔黨參”又名“貴州黨參”、“臭參”等，為桔梗科黨參屬植物管花黨參Codonopsis tubulosa Kom.的干燥根。其體結(jié)實(shí)肥壯，質(zhì)堅(jiān)而木質(zhì)不重，有香氣，嚼之能化渣，曾是歷史上有名的“敘黨”，享有較高聲譽(yù)。該藥材為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版收載品種，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺等功效，用于治療脾胃虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴等證[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黔黨參還具增強(qiáng)造血功能、抗血栓、調(diào)血脂、抗心肌缺血缺氧、改善血液循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。黔黨參為貴州的道地藥材，在民間常作為黨參入藥使用，其原植物管花黨參在貴州西北部分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)藏量大，具有廣闊的開發(fā)利用前景。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)黔黨參的化學(xué)成分指紋圖譜進(jìn)行研究[2-13]，以期對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行較為全面、客觀地評(píng)價(jià)，為其質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀、化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；AG135型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；CSF-1 B型超聲波清洗儀（上海超聲波儀器廠，功率：100 W，頻率：50 kHz）；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A版、2004 B版（國(guó)家藥典委員會(huì)，以下簡(jiǎn)稱“指紋圖譜軟件”）。

1.2 試劑

黨參炔苷對(duì)照品（江西本草天工科技有限責(zé)任公司，純度＞98%）；乙腈為色譜純，正丁醇、甲醇、乙醇、磷酸、冰醋酸均為分析純，水為重蒸水。

1.3 藥材

10批藥材樣品均由筆者于2009年7月采集，并經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定為管花黨參C.tubulosa Kom.的干燥根，憑證標(biāo)本存放于貴陽中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館。鮮品采回后洗凈，60℃烘干，粉碎過40目篩，置干燥器中，備用。樣品產(chǎn)地及編號(hào)如下：貴州威寧縣馬擺大山（S1），貴州威寧縣黑石鎮(zhèn)（S2），貴州清鎮(zhèn)市站街鎮(zhèn)（S3），貴州清鎮(zhèn)市麥格鄉(xiāng)（S4），貴州普安縣盤水鎮(zhèn)（S5），貴州貴陽市金華鎮(zhèn)（S6），貴州大方縣鳳山鄉(xiāng)（S7），貴州大方縣百納鄉(xiāng)（S8），貴州畢節(jié)市朱昌鎮(zhèn)（S9），貴州織金縣珠藏鎮(zhèn)（S10）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：依利特-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10min，2%→5%A；10～30min，5%→6%A；30～55min，6%→12%A；55～65 min，12%→16%A；65～100 min，16%→17%A；100～120 min，17%→25%A；120～165 min，25%→80%A）；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取黨參炔苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成每1 ml含黨參炔苷0.1 mg的溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇超聲提取3次（30、30、30 ml），每次30 min，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)盟芙夂?，以水飽和正丁醇分別萃取4次（40、30、30、20ml），合并提取液，揮干正丁醇，殘?jiān)眉状既芙?、轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，在上述色譜條件下測(cè)定，所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 A版）進(jìn)行分析，可得相似度計(jì)算結(jié)果均＞0.999，表明本方法精密度良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品粉末6份，每份約5 g，精密稱定，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 A版）進(jìn)行分析，可得相似度計(jì)算結(jié)果均＞0.995，表明本方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，在上述色譜條件下，分別于0、6、12、24 h依法測(cè)定，所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 A版）進(jìn)行分析，可得相似度計(jì)算結(jié)果均＞0.980，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7 樣品測(cè)定

取10批黔黨參藥材樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取空白溶劑、黨參炔苷對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別注入HPLC儀測(cè)定，記錄190 min的色譜圖，即得。

2.8 指紋圖譜共有峰的確定

將10批黔黨參藥材樣品的HPLC圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 A版），經(jīng)設(shè)定參照譜及自動(dòng)匹配，對(duì)其峰數(shù)、峰值（積分值）和峰位（相對(duì)保留時(shí)間）等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析、比較，制定優(yōu)化的指紋圖譜。確定13個(gè)峰為共有峰，根據(jù)黨參炔苷對(duì)照品HPLC圖與供試品HPLC圖對(duì)應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間及紫外光譜圖比較結(jié)果，確認(rèn)9號(hào)峰為黨參炔苷峰，并設(shè)定其為參照峰。計(jì)算可得，13個(gè)共有峰峰面積的RSD為49.67%～100.93%，峰面積比值的RSD為40.86%～127.97%；共有峰的相對(duì)保留時(shí)間為0.441～1.675，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.11%～1.50%。10批黔黨參藥材樣品的HPLC指紋圖譜及其共有模式見圖1；對(duì)照指紋圖譜見圖2。

3 討論

由圖1可知，10批黔黨參藥材樣品指紋圖譜中主要色譜峰的整體圖貌基本一致；從相似度評(píng)價(jià)結(jié)果來看，不同產(chǎn)地黔黨參藥材指紋圖譜的相似度均在0.923以上，相似度較高，且每批藥材13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜3%，表明本方法建立的黔黨參藥材對(duì)照指紋圖譜具有較好的代表性和重復(fù)性，為該藥材的質(zhì)量控制提供了有效的信息。但從其共有峰的峰面積比值計(jì)算結(jié)果來看，同一采收時(shí)間不同產(chǎn)地黔黨參所含成分的含量差異相對(duì)較大，表明黔黨參所含成分含量受地域性差異影響較明顯。

圖1 10批黔黨參藥材樣品的HPLC指紋圖譜及其共有模式（中位數(shù)法）Fig 1 HPLC fingerprints of 10batches of C.tubulosa and common pattern（median method）

圖2 對(duì)照指紋圖譜（中位數(shù)法）9.黨參炔苷Fig 2 Contrast fingerprints（median method）9.lobetyolin

另外，筆者還將在市場(chǎng)購買的其他黨參藥材——洛龍黨參（S11）、潞黨（S12）、甘肅黨參（S13），照上述方法測(cè)定并記錄HPLC圖，分別導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 B版）進(jìn)行分析，并與黔黨參對(duì)照指紋圖譜比較，其相似度評(píng)價(jià)計(jì)算結(jié)果分別為甘肅黨參0.522、潞黨0.093、洛龍黨參0.121。同屬其他黨參藥材與黔黨參的指紋圖譜相似度較低，表明它們之間的化學(xué)成分差異較大，所建立的黔黨參對(duì)照指紋圖譜具有較強(qiáng)的專屬性。黔黨參與其他品種黨參藥材的原始圖譜比較見圖3。

圖3 黔黨參與其他品種黨參藥材的原始圖譜比較Fig 3 Original map of C.tubulosa and other variety

在本試驗(yàn)中，筆者分別采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%冰醋酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，流動(dòng)相為乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液時(shí)的洗脫效果差異不甚明顯，色譜峰分離情況不夠好；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液和甲醇-水的洗脫效果較差；流動(dòng)相為乙腈-0.2%冰醋酸水溶液時(shí)各色譜峰分離度大，峰形也較好，故選擇之。

筆者分別采用依利特-C18（250mm×4.6mm，5μm）、Agilent Zorbax Extend-C18（250mm×4.6mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）和 Diamonsil（鉆石）-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明采用依利特-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱所得譜峰最多，各色譜峰分離度大，且峰形最好，故選擇之。

本試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)考察5個(gè)波長(zhǎng)——220、240、254、270、300 nm的色譜峰分離情況，發(fā)現(xiàn)在220 nm波長(zhǎng)處色譜峰分離不好，且漂移現(xiàn)象嚴(yán)重；240 nm和254 nm波長(zhǎng)處雖然漂移不嚴(yán)重，但色譜峰分離也不好；在270 nm和300 nm波長(zhǎng)處的色譜峰分離較好，但在300 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)的色譜峰個(gè)數(shù)不及270 nm波長(zhǎng)處多，故選擇270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

[1]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].2003年版.貴陽：貴州科技出版社，2003：280.

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