張麗靜，趙增仁，賀新奇，田延鋒

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，石家莊 050031）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是我國最常見的惡性腫瘤之一。病因尚未完全清楚，目前認(rèn)為主要是環(huán)境因素與遺傳因素綜合作用的結(jié)果。PINCH是新近發(fā)現(xiàn)的LIM（Lin-11、Isl-1和Mec-3）家族中的一員，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系［1］。研究發(fā)現(xiàn)，PINCH mRNA及蛋白在CRC組織中的表達(dá)明顯上調(diào)［2，3］。本研究擬采用DNA直接測序方法檢測CRC患者PINCH基因多態(tài)性位點(diǎn)，旨在了解CRC患者PINCH基因的遺傳變異情況，探討PINCH基因單核甘酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與 CRC 的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：選取36例CRC患者（CRC組）和30例非CRC人群（非CRC組）的基因組DNA作為樣本。CRC患者手術(shù)過程中同時(shí)留取腫瘤組織標(biāo)本（36例）及遠(yuǎn)端正常黏膜標(biāo)本（31例）。CRC組：為就診于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院的未經(jīng)放化療處理的初診為CRC的患者，其中，男21例，女15例，平均年齡（65.2±10.1）歲，均經(jīng)組織病理學(xué)診斷為 CRC；非CRC組：來自石家莊市，年齡和居住地與病例組匹配。

1.1.2 儀器與試劑：血液標(biāo)本DNA快速純化試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye及 PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒（生工生物工程有限公司）。GeneAmp PCR儀擴(kuò)增儀（加拿大BBI公司）；3730測序分析儀（美國ABI公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA抽提：抽取2組靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，按照DNA抽提試劑盒說明抽提外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)：對PINCH基因外顯子區(qū)域進(jìn)行檢測（其中1號(hào)外顯子起始位置差異較大，共計(jì)6段不同的序列）。采用DNASTAR引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)引物14對。進(jìn)行BLAST同源性檢索，與其他基因無同源性。引物由生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

1.2.3 PINCH基因外顯子區(qū)的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化：擴(kuò)增體系 25 μL：反應(yīng)緩沖液 2.5 μL，dNTPs（10mmol/L）0.5 μL，引物 F（10 μmol/L） 和引物 R（10 mmol/L）各 0.5 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O。94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 30 s，56℃退火30～60 s，72℃延伸1 min，30～35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，4℃保存。采用膠回收DNA純化試劑盒常規(guī)純化PCR產(chǎn)物。取2 μL電泳，其余-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PINCH基因擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequence of PINCH gene

1.2.4 DNA測序：對純化產(chǎn)物進(jìn)行熒光染料循環(huán)測序法雙向測序（上海生工生物技術(shù)有限公司）。應(yīng)用Chromas和DNAman軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析比對。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對PINCH基因的SNP等位基因型頻率采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA抽提

抽提基因組DNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測，OD260/280比值在1.8～2.0之間，DNA電泳結(jié)果提示DNA純度及完整性基本達(dá)到測序分析的要求。見圖1。

圖1 DNA電泳結(jié)果Fig.1 Image of DNA electrophoresis

2.2 PCR擴(kuò)增與純化

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外透射儀觀察，可見目標(biāo)基因均特異有效地得到了擴(kuò)增，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符，見圖2。

2.3 測序比對結(jié)果

對PINCH基因10個(gè)外顯子分別進(jìn)行測序，結(jié)果顯示：1號(hào)外顯子（6個(gè)不同起始點(diǎn)的6段DNA序列）未發(fā)現(xiàn)存在堿基改變；從2號(hào)外顯子開始，共檢測到10個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變。其中7個(gè)位點(diǎn)可在SNP數(shù)據(jù)庫中查到，分別是 rs74632558，rs1053766，rs112186831，rs111660688，rs111779374，rs113387660和rs115305258，見表2。另外，有3個(gè)位點(diǎn)未在SNP數(shù)據(jù)庫中查到，其中109276129位于2號(hào)外顯子，109292340和109292357分別位于5號(hào)和6號(hào)外顯子。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis image of PCR amplification of PINCH

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：rs112186831，rs111660688，rs111779374，rs113387660，rs115305258 基因型均為同義突變，且在CRC標(biāo)本和非CRC標(biāo)本相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)發(fā)現(xiàn)位于2號(hào)外顯子的109276129及分別位于5號(hào)和6號(hào)外顯子的109292340和109292357位點(diǎn)共計(jì)3個(gè)SNP在美國國立生物技術(shù)信息中心未檢索到。另外發(fā)現(xiàn)，rs1053766位于染色體位置 109276178，GCG→GTG，編碼氨基酸由Ala→Val，但是在CRC和非CRC標(biāo)本間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是值得注意的是位于Exon 2的rs74632558由CGC→CAC，編碼氨基酸由Arg→His，同時(shí)在CRC標(biāo)本和非CRC標(biāo)本間其分布有差異。CRC標(biāo)本中57.7%表現(xiàn)為A/G基因型，而非CRC標(biāo)本中A/G基因型比例為36.7%，見表3。但在同一患者中，CRC腫瘤組織標(biāo)本和與其匹配的正常黏膜間A/G基因型比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.635），見表4。

表2 PINCH基因外顯子測序結(jié)果Tab.2 The sequencing results of exon of PINCH gene

表3 rs74632558等位基因型頻率情況Tab.3 The frequency of rs 74632558 allelotype in different groups

表4 rs74632558在腫瘤組織及正常黏膜間的基因型分布Tab.4 The genotype distribution of rs 74632558 in tumor and the normal mucosa

3 討論

研究表明，CRC的發(fā)生是多因素、多基因共同作用的結(jié)果。PINCH基因在整合素和生長因子信號(hào)的傳導(dǎo)中起著十分重要的接頭聯(lián)結(jié)作用，參與細(xì)胞的黏附、遷移等基礎(chǔ)功能，并與多種腫瘤的發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)［1～8］。人PINCH基因位于染色體2q12.3，基因組大小為152 846 bp（109150857-109303702），由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成。其中1號(hào)外顯子中包含6個(gè)不同起始點(diǎn)的編碼氨基酸的DNA序列。PINCH蛋白由50～60個(gè)氨基酸組成，分子量為37 kDa。研究表明，PINCH在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中PINCH蛋白及mRNA的表達(dá)較正常黏膜明顯增高，而且PINCH高表達(dá)和患者的預(yù)后有關(guān)。

為了探討PINCH在腫瘤中的高表達(dá)是否與基因組突變有關(guān)，本研究隨機(jī)選取了CRC患者及非CRC人群，采用DNA直接測序方法檢測PINCH基因所有蛋白編碼區(qū)堿基的改變，分析了其可能的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PINCH基因存在不同的SNP。SNP是人類基因組中廣泛存在的遺傳變異，主要表現(xiàn)為單個(gè)核苷酸的置換，在群體中的分布頻率不低于1%，具有高密度穩(wěn)定和易于分型檢測的優(yōu)勢［9］。本研究利用小樣本對特定的研究人群PINCH基因10個(gè)外顯子區(qū)進(jìn)行測序，共篩查到10個(gè)SNP，約600 bp就可檢測到 1個(gè) SNP。其中 Exon1、3、4和 Exon8～Exon10中未檢測到 SNP，Exon2中共檢測到3個(gè)SNP，Exon6中檢測到5個(gè)SNP，其中有4個(gè)可以在SNP數(shù)據(jù)庫中檢索到。Exon2中有1個(gè)未在SNP數(shù)據(jù)庫比對中檢索到。而Exon5中亦檢測到有1個(gè)位點(diǎn)與SNP數(shù)據(jù)庫比對未發(fā)現(xiàn)，考慮可能為新的SNP位點(diǎn)。

基因調(diào)控序列中的SNP可影響基因表達(dá)水平［10］。CRC組織中PINCH基因的高表達(dá)可能是SNP作用的結(jié)果。作為一種多基因遺傳病，CRC的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的遺傳背景有關(guān)。目前，在多基因遺傳病研究中，SNP研究顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值。多項(xiàng)研究表明，CRC的發(fā)生可能與基因多態(tài)性有關(guān)［11～13］。本研究采用DNA直接測序方法篩查PINCH基因多態(tài)性位點(diǎn)，為進(jìn)一步了解PINCH基因SNP與CRC的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于PINCH基因2號(hào)外顯子區(qū)的rs74632558在CRC患者中更多的表現(xiàn)為A/G基因型，而非CRC人群中A/G基因型比例降低，因此推測高A/G可能與CRC的發(fā)生具有一定相關(guān)性。當(dāng)然，由于本研究選擇的病例數(shù)較少，rs74632558是否對PINCH的表達(dá)有調(diào)控作用尚需要后續(xù)加大樣本量證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，利用直接測序法可有效篩查出特定人群PINCH基因存在的SNP，通過估算基因頻率可初步了解SNP在特定群體中的分布情況。預(yù)測SNP可能的應(yīng)用價(jià)值為后續(xù)利用SNP標(biāo)志進(jìn)行CRC風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測奠定了研究基礎(chǔ)。

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