馬 力,楊麗梅,王 艷,郭時金,沈志強*, 張 穎

(1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600；2. 山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東，濱州256600)

兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)俗稱兔瘟，是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的兔的一種烈性、急性、毀滅性、高度接觸性傳染病[1-2]，該病于1984年在我國江蘇地區(qū)首次爆發(fā)后，迅速向全世界范圍內(nèi)擴散，現(xiàn)已呈全球性流行，具有傳播速度快、高發(fā)病率和高死亡率等主要流行特征，該病被世界動物衛(wèi)生組織列為B類動物傳染病，被我國農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局列為二類動物疫病[3-8]。本研究對兔出血癥病毒ZB分離株的VP60基因進(jìn)行了序列分析以及VP60蛋白的主要抗原區(qū)域進(jìn)行了原核表達(dá)與鑒定，旨在豐富我國RHDV地方分離毒株資源，為RHDV分子流行病學(xué)調(diào)查提供參考，為VP60蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究、RHDV抗體檢測試劑盒及新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌毒株、載體及血清

克隆菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)菌株BL21(DE3)由山東省濱州獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室制備并保存；兔出血癥病毒ZB分離株由山東省濱州獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室分離并保存(將在另文發(fā)表)；原核表達(dá)載體pET30a由山東省濱州獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室保存；兔病毒性出血癥陽性血清與陰性血清由山東綠都生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑與試劑盒

rTaq酶、Hind III、BamH I內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自寶生物(大連)工程有限公司；鎳離子親和層析柱購自GE Healthcare；病毒基因組RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)Genbank登錄兔出血癥病毒基因組序列(Genbank登錄號：JN851734.1)，設(shè)計擴增VP60蛋白的一對特異性表達(dá)引物：F1 5'-3' ATAGGATCCGGCATGC AGTTCCGCTTCAT；R1 5'-3' ATTCAAGCTTCTACGGCATAAATGGGCTTAG，(下劃線部分表示引入的BamH I/Hind III酶切位點)，該對引物擴增VP60基因345 bp至1 221 bp的主要抗原區(qū)域，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 分離病毒基因組RNA的提取及cDNA合成

取分離病毒200 μL，按RNA抽提試劑盒的使用說明提取病毒基因組RNA，分離病毒基因組RNA為模板，按M-MLV酶說明進(jìn)行cDNA合成。

1.5 目的基因片段的PCR擴增及表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以測序正確的pMD-VP60重組質(zhì)粒為模板，用設(shè)計的表達(dá)引物(F2/R2)進(jìn)行表達(dá)基因片段的PCR擴增，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min、58 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min、35個循環(huán)，72 ℃10 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，利用BamH I/Hind III雙酶切后膠回收試劑盒回收基因片段，連接至經(jīng)BamH I/Hind III雙酶切純化的pET30a原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化克隆菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA，用BamH I/Hind III雙酶切鑒定，鑒定正確的陽性質(zhì)粒命名為pET30a-VP60，將其送測序公司進(jìn)行序列測定，以驗證其閱讀框架是否正確。

1.6 VP60重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與表達(dá)形式鑒定

將鑒定正確的pET30a-VP60陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，加5 mL LB液體培養(yǎng)基過夜增菌，次日取2 mL加入至含200 mL LB液體培養(yǎng)基的三角錐形瓶中，于37℃搖床中培養(yǎng)至OD600值約為0.7時，加入200 μL濃度為1 mol/L的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)5 h后離心收集菌液，經(jīng)超聲波破碎后以10 000 r/min離心10 min，收集上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析，鑒定目的蛋白的表達(dá)形式。

1.7 VP60重組蛋白的純化

用8 mol/L尿素溶解以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白，包涵體溶解后按GE Healthcare公司的鎳離子親和層析柱使用說明純化溶解的包涵體蛋白，重組蛋白過柱純化后，梯度透析復(fù)性，復(fù)性結(jié)束后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析鑒定蛋白的純化效果。

1.8 VP60重組蛋白的活性鑒定

取純化的pET30a-VP60重組蛋白與pET30a空載體誘導(dǎo)表達(dá)菌經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，分別與兔病毒性出血癥陽性血清與陰性血清(1∶100倍稀釋)反應(yīng)，洗滌后，與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶4000倍稀釋)反應(yīng)，洗滌后，利用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺底物緩沖液進(jìn)行顯色。

1.9 間接ELISA檢測方法的建立與初步應(yīng)用

以純化的重組VP60蛋白作為包被抗原、兔出血癥病毒陽性與陰性血清蛋白作為一抗、HRP標(biāo)記兔抗鴨酶標(biāo)抗體為二抗，采用方陣滴定法測定抗原抗體的最佳工作濃度與作用時間，以建立的間接ELISA檢測方法與血凝抑制試驗同時對116份兔血清進(jìn)行檢測，計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 VP60表達(dá)基因片段的RT-PCR擴增與表達(dá)載體的鑒定

用設(shè)計的表達(dá)引物(F1/R1)對RHDV基因組進(jìn)行RT-PCR擴增，得到了預(yù)表達(dá)的876 bp特異性DNA條帶(見圖1)。PCR擴增產(chǎn)物定向克隆至pET30a構(gòu)建的pET30a-VP60原核表達(dá)載體經(jīng)BamH I/Hind III雙酶切鑒定得到5 900 bp和876 bp兩條片段(見圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符，測序結(jié)果表明其閱讀框正確，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 VP60重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖1 RT-PCR擴增結(jié)果Fig. 1 Result of PCR AmplificationM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.RT-PCR擴增產(chǎn)物；2.對照M.DNA Marker DL 2000;1.Product of RT-PCR;2.control

圖2 表達(dá)載體酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant expression vectorM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL15000;1-3.質(zhì)粒pMD-VP60 BamH I/Hind III酶切M.DNA Marker DL 15000;1.Recombinant expression vector digested by BamH I/Hind IIII.

如圖3所示，pET30a-VP60陽性重組質(zhì)粒在表達(dá)菌株BL21(DE3) 中得到了正確表達(dá)，重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)蛋白的分子量約為40 ku，與預(yù)期相符。

2.3 VP60重組蛋白的純化結(jié)果

以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白用8 mol/L尿素溶解后，采用鎳離子親和層析柱對其進(jìn)行過柱純化后，梯度透析復(fù)性，如圖4所示，SDS-PAGE電泳檢測表明蛋白純化效果較好，純度較高。

2.4 VP60重組蛋白的活性鑒定結(jié)果

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombination protein

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.Pet30a表達(dá)產(chǎn)物對照;2.Pet30a-VP60未誘導(dǎo)對照;3.Pet30a-VP60表達(dá)產(chǎn)物;4.超聲破碎后沉淀;5.超聲破碎后上清

M.Protein molecular weight Marker;1.Expression product of Pet30a;2.Non induced control of Pet30a-gD;3.Expression product of Pet30a-gD;4.Pellets after ultrasonic disruption;5.Supernatant after ultrasonic disruption

圖4 純化蛋白SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified protein

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.純化蛋白

M.Protein molecular weight Marker;1.Purified protein

圖5 重組蛋白的活性鑒定Fig.5 Western blot of expressed products

1.純化蛋白與陽性血清作用;2.pET30a表達(dá)菌與陽性血清作用; 3.純化蛋白與陰性血清作用; 4.pET30a表達(dá)菌與陰性血清作用

1.Purified protein react with positive serum; 2.Control of pET30a with positive serum.3.Purified protein react with negative serum; 4.Control of pET30a with negative serum.

如圖5所示，重組VP60純化蛋白能與兔病毒性出血癥陽性血清反應(yīng)較好，與兔病毒性出血癥陰性血清不發(fā)生任何反應(yīng)，而pET30a空載體誘導(dǎo)表達(dá)菌與兔病毒性出血癥陽性血清、陰性血清反應(yīng)均不發(fā)生任何反應(yīng)，重組VP60純化蛋白表現(xiàn)出了良好的特異性與反應(yīng)活性。

2.5 間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用結(jié)果

經(jīng)過方陣滴定試驗確定重組抗原最佳包被濃度為3.08 μg/mL；血清最佳稀釋度為1∶100，酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1∶5000，最佳作用時間為37 ℃ 1 h，以建立的間接ELISA檢測方法與血凝抑制試驗檢測116份兔血清樣品，間接ELISA檢測出陽性86份，陽性率為74.1 %；血凝抑制試驗檢測出陽性82份，陽性率為70.7 %。二者檢測均陽性的樣品為80份，均陰性的樣品28份，二者的符合率為93.1%，建立的間接ELISA方法表現(xiàn)出了良好的準(zhǔn)確性與實用性。

3 討 論

目前，兔病毒性出血癥是危害養(yǎng)兔業(yè)最為嚴(yán)重的動物疫病，可給感染兔群帶來毀滅性的災(zāi)難，嚴(yán)重阻礙了我國養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展，故應(yīng)持續(xù)加強對兔病毒性出血癥病毒序列變異分析、抗體普查監(jiān)測等分子流行病學(xué)與血清學(xué)診斷等研究工作。目前常用的RHDV抗體檢測方法是血凝抑制試驗(HI)，HI試驗需要人“O”型紅血球，血清需經(jīng)過吸附處理，過程較為繁瑣；結(jié)果判定易受許多主、客觀因素的影響，所以在實際應(yīng)用中受到很多限制。而ELISA診斷方法具有特異性和敏感性強、快速、準(zhǔn)確、通量高等特點，是動物傳染病檢疫、免疫抗體水平監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查廣泛采用的診斷技術(shù)。目前由于尚沒有體外培養(yǎng)RHDV的細(xì)胞系，RHDV診斷試劑的抗原均來源于感染兔的肝臟組織，由于組織毒抗原制備過程繁瑣、純化難度大，同時存在散毒的危險，也不符合動物福利的要求，使利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得基因工程抗原成為RHDV新型診斷試劑與疫苗研究的熱點。故本研究在成功獲得RHDV ZB株VP60全基因序列后，設(shè)計合成特異性表達(dá)引物，利用pET30a原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了RHDV ZB株VP60蛋白主要抗原區(qū)域，經(jīng)鎳離子親和層析純化方法獲得了純度良好的重組VP60蛋白，免疫印跡鑒定表明該重組VP60蛋白能與兔病毒性出血癥陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而與兔病毒性出血癥陰性血清不發(fā)生任何反應(yīng)，表現(xiàn)出了良好的特異性與反應(yīng)活性，以該蛋白作為診斷抗原，建立了檢測兔瘟病毒抗體的間接ELISA診斷方法，該間接ELISA診斷方法與血凝抑制試驗的符合率高達(dá)93.1 %，表現(xiàn)出了良好的準(zhǔn)確性與實用性。本研究中基因工程抗原的成功獲得與間接ELISA抗體檢測方法的成功建立，將為進(jìn)行VP60蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究、RHDV抗體檢測試劑盒及新型疫苗的研制奠定重要基礎(chǔ)。

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