江 燕，鐘曉琳，王明民，李紅軍，翟 磊，高騰云

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

河南省南陽黑豬又稱宛西八眉豬，其體型中等，頭較短，額部有菱形皺紋，最上面兩條皺紋形似八字，故名“八眉”；主產(chǎn)區(qū)位于伏牛山脈南麓丘陵地區(qū)、緩坡地帶和山前平原，為河南省地方優(yōu)良種質(zhì)資源品種之一。欒川黑豬產(chǎn)于豫西伏牛山欒川縣，頭形稍長，額部有皺紋，嘴長短中等，耳大稍前傾斜，下垂等特點。伏牛山區(qū)是一個典型的生態(tài)交錯帶[1]，這種生態(tài)環(huán)境的差異致使南陽黑豬與欒川黑豬在外部形態(tài)上存在顯著差異；因而，正確認(rèn)識兩者之間的遺傳關(guān)系并加以合理保護(hù)利用已成為當(dāng)務(wù)之急。

由于微衛(wèi)星具有高變異性、高突變率、數(shù)量大、共顯性遺傳及在基因組中廣泛分布等特點[2]，因而在群體內(nèi)、間分析遺傳廣為使用。國內(nèi)外關(guān)于豬微衛(wèi)星研究有不少報道[3-11]，但較少涉及對黑豬種群遺傳關(guān)系分析，而南陽與欒川黑豬間遺傳關(guān)系分子研究未見報道。鑒于此，本研究利用10個微衛(wèi)星標(biāo)記對南陽和欒川黑豬群體遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，為兩種黑豬品種鑒定的系統(tǒng)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試豬樣本 南陽黑豬46頭，均采自南陽黑豬主產(chǎn)區(qū)。其中30頭采自南召縣普尼爾農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，10頭采自內(nèi)鄉(xiāng)縣南陽黑豬保種場，6頭采自西峽縣詹鐵軍養(yǎng)殖場。欒川黑豬30頭采自洛陽欒川縣亨利養(yǎng)殖場。隨機(jī)采樣前腔靜脈采血，每頭約5 mL，肝素鈉抗凝；血樣用冰塊冷藏運回實驗室，-20 ℃冷凍保存。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：Go Taq Green Master Mix/ M7122(美國Promega公司)，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、N',N',N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、Tris(Sigma公司)，PBR322 DNA/MspI(鄭州寶賽)。儀器：9700PCR擴(kuò)增儀(ABI)，T-PCR儀，Labwork凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha innotech)，DYY-lOC型水平電泳槽(北京)，1-14型低溫高速離心機(jī)(sigma)。

1.1.3 微衛(wèi)星引物 這些引物的選擇是從已發(fā)表的文獻(xiàn)上獲取的。10對微衛(wèi)星引物均由上海生物工程技術(shù)公司合成，10對微衛(wèi)星引物信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用常規(guī)酚-氯仿抽提法進(jìn)行提取，配合使用全血基因組DNA提取試劑盒，檢測合格后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 10對微衛(wèi)星引物的的信息Table 1 Information of ten microsatellite primers

1.2.2 PCR反應(yīng)條件 反應(yīng)體系10 μL，其中模板DNA1μL(50～100 ng)，Go Taq PCR Master Mix,2×為5.0 μL，上游引物和下游引物均為1 μL，Nucleas-Free Water 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，30 cycles(94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及電泳分型 取2.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加6倍稀釋的上樣緩沖液1 μL混勻，用2%瓊脂糖凝膠(GoodView染色)，并以Marker作對照，在5～8 v/cm電壓下電泳1 h，在凝膠成像系統(tǒng)中對照Marker觀察是否有所需條帶，對無帶和不在所需范圍的，重新擴(kuò)增。有條帶的進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其片段大小。

1.3 統(tǒng)計分析

以分子量標(biāo)記物(pBR322/MspⅠ)為標(biāo)準(zhǔn)，利用BandScan4.50分析軟件讀取各微衛(wèi)星位點的基因型和片斷大小，并用Cervus2.0軟件分析各位點的等位基因頻率、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、觀察等位基因數(shù)(Na)和多態(tài)信息含量(PIC)。用Popgen32計算有效等位基因數(shù)(Ne)及Nei's遺傳距離和相似度。采用SPASS17.0軟件包進(jìn)行t檢驗，試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分微衛(wèi)星位點聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

微衛(wèi)星遵循孟德爾定律，呈共顯性遺傳。如果一個二倍體相對位點微衛(wèi)星核心重復(fù)數(shù)相同，則這個位點為純合基因型，反應(yīng)在凝膠電泳片上是一條帶，即為純合子。若核心重復(fù)數(shù)不同，可能由堿基插入或缺失等原因，因而為雜合型，即為兩條帶，若無條帶出現(xiàn)則表明為無效等位基因。圖1為其中兩個位點在黑豬群體中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。

圖1 2個微衛(wèi)星位點聚丙烯酰胺凝膠電泳 Fig.1 Denatured polyacrylamide gel electrophoresis of two loci

注：上、下圖分別表示SWR308位點和SW787位點在不同黑豬個體間的擴(kuò)增圖譜；其中，1-17：表示黑豬不同個體；M代表pBR322/MspⅠDNA Marker。

Note： The above two figures represent the PCR of different black pigs on the loci of SWR308 and SW787, in which 1-17 represent the different individuals of black pigs; M stands for pBR322/MspⅠDNA Marker.

2.2 等位基因及其頻率

南陽黑豬46個個體在10個微衛(wèi)星位點上共檢測116個等位基因，平均每個位點11.6個等位基因；在欒川黑豬30個個體共檢測88個等位基因，平均每個位點8.8個。南陽黑豬群體中，SW781位點上檢測到14個等位基因，為數(shù)目最多的，范圍在134～244 bp；欒川黑豬群體的S0090檢測基因數(shù)最多，達(dá)12個，變化范圍為230～338 bp；可見兩黑豬群體等位基因間存在較大差異(見表2)。

表2 兩黑豬群體10個微衛(wèi)星位點等位基因分析Table 2 The allele analysis of two black pig populations at 10 microsatellite loci

2.3 群體內(nèi)遺傳變異分析

由表3可知，兩黑豬群體10個微衛(wèi)星位點均呈高度多態(tài)性(PIC>0.5)，范圍分別為0.834～0.904和0.753～0.896。其中，南陽黑豬群體中除S0090位點上多態(tài)性信息含量低于欒川黑豬群體外，其余均高于后者。觀察雜合度在兩群體間并無太大差異，多為1.000。10個位點中，兩黑豬群體的期望雜合度普遍低于觀察雜合度，南陽黑豬S0026位點的期望雜合度最低(0.861)，欒川群體中SW951位點為最低(0.796)。10個微衛(wèi)星位點在兩黑豬群體中均得到了較多的等位基因數(shù)，其中，南陽黑豬的SW781為最多，達(dá)到14個，而欒川黑豬群體中S0090位點高達(dá)12個。就有效等位基因數(shù)來說，南陽黑豬群體的多數(shù)位點高于欒川黑豬群體，二者變動幅度均較大，分別為6.73～11.20和4.42～10.47。

將兩黑豬群體的多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察等位基因數(shù)(Na)和期望雜合度(He)分別進(jìn)行t檢驗分析，并輸出P值，結(jié)果見表4。由表4可知，黑豬在10個位點的遺傳變異結(jié)果。

表3 兩黑豬群體在10個位點的遺傳變異結(jié)果Table 3 The genetic variation of two black pig populations at 10 microsatellite loci

表4 黑豬在10個位點的遺傳變異結(jié)果分析Table 4 The genetic variation analysis of black pig populations at 10 microsatellite loci

注：表中同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)。

Note： Values with different capital letter superscripts in the same row show extreme difference (P<0.01).

2.4 群體間遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離

遺傳相似系數(shù)是衡量群體間遺傳變異程度的可靠參數(shù)。親緣關(guān)系越近，則遺傳變異性越低，相似系數(shù)越大[12]。本研究依據(jù)10個微衛(wèi)星位點的等位基因頻率，運用Popgene32軟件計算了兩黑豬群體間的遺傳相似系數(shù)和Nei氏遺傳距離。結(jié)果顯示，南陽黑豬和欒川黑豬群體間遺傳相似系數(shù)為0.7317，遺傳距離為0.3124，兩群體間存在顯著遺傳分化。

3 討 論

3.1 黑豬群體內(nèi)遺傳變異分析

等位基因是估計和比較遺傳多樣性及計算遺傳距離的最基本數(shù)據(jù)，也是衡量微衛(wèi)星座位多態(tài)性的一個重要參數(shù)。Baker等[13]提出每個微衛(wèi)星位點至少應(yīng)該有4個等位基因才能較好的用于遺傳多樣性分析。本研究中兩黑豬群體的10個微衛(wèi)星位點中，等位基因數(shù)均在4個以上。等位基因值越大表明微衛(wèi)星位點的基因多態(tài)性越好，因此本試驗所選的10個微衛(wèi)星位點均為高度多態(tài)位點，可用于兩黑豬群體的遺傳變異分析。在同一個微衛(wèi)星位點上，等位基因數(shù)目和頻率的差異能反映出家畜品種內(nèi)和品種間的差異，并可借此區(qū)分品種的類型；而基因頻率本身也可以反應(yīng)出群體之間的遺傳相似度。由兩黑豬群體各位點間等位基因的顯著性差異可以看出，兩群體間的遺傳結(jié)構(gòu)差異很大，且遺傳相似度較低。一些等位基因在南陽黑豬某一位點中頻率非常高，但在欒川黑豬群體同一位點中頻率較低或者沒有分布，顯然，這與兩黑豬群體的育種歷史及所處生態(tài)條件有關(guān)。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因變異程度高低，反映遺傳信息和基因豐度的一個指標(biāo)。Botstein等[14]提出了衡量基因變異程度高低的指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5時，該位點為高度多態(tài)性位點；當(dāng)0．25

群體的雜合度(H)又稱為基因多樣度，反映群體在多個基因位點上的變異，因而是度量群體遺傳變異的一個最適參數(shù)。[15]。就同一種標(biāo)記來說，群體平均雜合度的高低反應(yīng)了群體的遺傳一致性程度，群體雜合度越低，則群體的遺傳一致性越高，而群體的遺傳變異就越少，遺傳多樣性就越低。本研究中各位點雜合度均大于0.7，因而能很好的反應(yīng)兩黑豬群體的遺傳多樣性。兩黑豬群體的平均觀察雜合度均高于平均期望雜合度，且差值較大，這表明兩群體處于不平衡狀態(tài)，或其群體內(nèi)都存在一定程度的近交。兩群體的平均期望雜合度之間呈極顯著性差異，這種遺傳差異很可能與兩群體所處的生態(tài)環(huán)境以及人為重視程度等方面密切相關(guān)。

有效等位基因數(shù)(Ne)也是反映群體遺傳變異程度的重要指標(biāo)，Hines等[16]指出等位基因在群體中的分布越均勻，則有效等位基因數(shù)就會越接近所檢測到的觀察等位基因數(shù)(Na)。而本研究中，兩黑豬群體的有效等位基因數(shù)均是只有個別與觀察等位基因數(shù)相近，大部分還是有差異的，由此可知，在這些基因座上，相應(yīng)群體的等位基因分布并不均勻，造成這種不均勻的原因可能是基因的流動、自然環(huán)境的差異或者基因突變。南陽黑豬群體的平均有效等位基因數(shù)和平均觀察等位基因數(shù)在多數(shù)位點上均高于欒川黑豬，這一差異可能是由于欒川黑豬進(jìn)行人為選育或改良時，基于一些性狀需求的選擇導(dǎo)致了某些位點上等位基因分布不均勻，從而失去了一些等位基因。但兩黑豬群體的平均有效等位基因數(shù)均很高，這說明在發(fā)生選擇、突變或遺傳漂變時，群體仍能有保持其等位基因的較強(qiáng)能力，而這也正是兩黑豬群體得以發(fā)展、延續(xù)的遺傳基礎(chǔ)。

3.2 黑豬群體間遺傳變異及地理分化

種群間遺傳變異通常是以等位基因頻率為基礎(chǔ)的遺傳距離來表示的，通過遺傳距離和遺傳相似性分析可以估測種群間的進(jìn)化關(guān)系。Thorp[17]通過研究發(fā)現(xiàn)：不同物種間遺傳距離Ds=0.2～0.5，同科屬群體間Ds=0.5～0.9，同種群體間Ds=0.03～0.2；同種群體間遺傳相似系數(shù)I=0.80～0.97。本研究中，南陽黑豬和欒川黑豬群體間遺傳相似系數(shù)為0.7317，群體間遺傳距離為0.3124，表明兩黑豬群體間存在顯著的遺傳分化，因此推斷二者可能屬于不同的品種。

4 結(jié) 論

南陽黑豬與欒川黑豬兩群體均具有較高的遺傳變異,遺傳多樣性豐富，但欒川黑豬群體的遺傳多樣性略低于南陽黑豬的。

南陽黑豬與欒川黑豬在遺傳結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，且試驗結(jié)果顯示兩黑豬群體間遺傳相似度較低，遺傳距離較遠(yuǎn)，兩群體間顯然產(chǎn)生了一定的遺傳分化，因而可能屬于不同的黑豬品種。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張建偉,曹 穎.伏牛山區(qū)植物的多樣性及其保護(hù)[J].河南大學(xué)學(xué)報,2000,30(1):76-81.

[2] Boyce W M, Hedrick P W, Muggli-Cockett N E, et al. Genetic variation of major histoc ompatibilty complex and microsatellite loci: a comparison in Bighorn sheep[J].Genetics,1996,145:421-433.

[3] 吳珮璐,徐厚強(qiáng),嵇辛勤,等.貴州白香豬群體遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(7):130-135.

[4] 白小青,范首君,王金勇,等.5個重慶地方豬種遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2010,41(12):1 515-1 522.

[5] 袁 文,王 靜,劉香梅,等.利用微衛(wèi)星標(biāo)記對五指山小型豬近交群的遺傳分析[J].實驗動物與比較醫(yī)學(xué),2012,32(4):329-333.

[6] 張 富,鞏元玲,欒慶江,等.三個微衛(wèi)星標(biāo)記在松遼黑豬中的遺傳多樣性研究[J].畜牧與飼料科學(xué),2010,31(9):57-59.

[7] 曹果清,李步高,石建中,等.應(yīng)用21個微衛(wèi)星標(biāo)記檢測馬身豬遺傳多樣性變化趨勢[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2010,41(8):932-938.

[8] Conyers C M, Allnutt T R, Hird H J, et al. Development of a Microsatellite-Based Method for the Differentiation of European Wild Boar (Sus scrofa scrofa) from Domestic Pig Breeds (Sus scrofa domestica) in Food[J].Agricultural and Food Chemistry,2012,60(13):3 341-3 347.

[9] Scali M,Vignani R,Bigliazzi J,et al.Genetic differentiation between Cinta Senese and commercial pig breeds using microsatellite[J].Electronic Journal of Biotechnology,2012,15(2):1-11.

[10] Chen Y C,Hsu J T, Chien C C, et al. Investigation of Genetic Relationships Among Taiwan Black Pigs and Other Pig Breeds in Taiwan Based on Microsatellite Markers[J].Animal Biotechnology,2012,23(4):278-290.

[11] Costa V, Pérez-González J, Santos P, et al. Microsatellite markers for identification and parentage analysis in the European wild boar(Sus scrofa)[J]. BioMed Central, 2012, 5:1-6.

[12] Plosky Y, Cahner A, Haberfeld A.DNA Fingerprint bands applied to linkage analysis with-quantitative trait loci in chickens[J].Animal Genetics,1993,24:105-110.

[13] Baker J S F,Moore S S, Hetzel D J S,et al. Genetic diversity of Asian water buffalo (Bubalus bubalis):microsatellite variation and a comparison with protein coding loci[J]. Animal Genetics, 1997,28:103-115.

[14] Botstein D, White R L, Skolnick M, et a1.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].The American Journal of Human Genetics, 1980, 32(3):314-331.

[15] 樊 斌,李 奎,彭中鎮(zhèn),等.湖北省三品種豬27個微衛(wèi)星座位的遺傳變異[J].生物多樣性, 1999,7(2):91-96.

[16] Hines H C, Zikakis J P, Haenlein G F W, et al. Linkage relationships among Loci of Polymorphism in Blood and Milk of Cattle[J].Journal of Dairy Science,1981,64(1):71-76.

[17] Thorp J P. The molecular dock hypothesis: Biochemical evolution, genetic differentiation and systematic[J].Annual Review of Ecology Systematic, 1982, 13(1):139-168.