駱 雪，張春勇 ，陳克嶙，郭榮富

(云南農業(yè)大學 云南省動物營養(yǎng)重點實驗室，云南 昆明 650201)

抗生素是微生物代謝的次級產物，在低濃度時能抑制動物病原菌的生長和繁殖，但抗生素長期大量使用及濫用，導致病原菌的耐藥菌株不斷增多，增加許多疾病的治療難度。因此，研究和應用安全新型抗生素替代品已成為重要課題內容。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽不但抗菌譜廣，而且不易使病原菌產生耐藥菌株，被認為是現(xiàn)有抗生素的最佳替代品，已成為抗菌研究及應用的熱點?；认x在我國分布廣泛，資源豐富易養(yǎng)殖，具有很強的抗病能力，存在獨特的免疫機制，迄今為止，對蝗蟲抗菌肽類物質的誘導表達及其抗菌效應尚未見報道。Boman等[1]誘導分離出第一種抗菌肽-天蠶素，與傳統(tǒng)的抗菌素生物肽不同，它是由真核細胞基因編碼的多肽類抗菌分子。研究表明，不同物種的抗菌肽一級結構具有不少相似之處[2]，即分子量小、呈堿性、N端親水、C端疏水、有兩個α螺旋、熱穩(wěn)定性好、不易被水解、無免疫原性等特點。在體外，抗菌肽濃度在10～100 μg/ mL時，對多種細菌就有殺傷作用，而在中性粒細胞中的濃度為mg/mL級，遠超過這個數(shù)值，表明抗菌肽在體內可能具有很強的殺菌活性[3]。目前已從昆蟲如天蠶蛹、果蠅、麻蠅等中分離得到了多種抗菌肽。研究表明，蝗蟲體內營養(yǎng)成分非常豐富，不但蛋白質和脂肪含量高、氨基酸和維生素種類較多，而且還含有大量人體必需的微量元素[4-5]。但對東亞飛蝗抗菌物質與抗菌效應的研究鮮見報道。本研究首次以典型植食性優(yōu)勢種，直翅目(Orthoptera)、蝗總科(Acridoidea)、東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)為材料，以針刺成蟲腹部，浸泡大腸桿菌菌懸液，采用乙酸銨緩沖液浸提方法以獲得含抗菌活性物質的粗提物，為防止蛋白酶的降解，加入合適蛋白酶抑制劑PMSF，再經透析等手段純化、分析檢測東亞飛蝗中抗菌肽類物質與抗菌效應，為東亞飛蝗新型抗菌肽研究和應用提供新的試驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，水稻白葉枯病原菌，均由云南農業(yè)大學微生物教研室提供。所有菌株均在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長。

1.1.2 東亞飛蝗 選取生長40～50 d左右的東亞飛蝗，云南祿勸東亞飛蝗養(yǎng)殖場贈送。

1.1.3 飼養(yǎng)管理 飼養(yǎng)籠用細長木棍制成相同規(guī)格的立方形蝗蟲籠架，用紗窗或醫(yī)用紗布制成立方形，一邊帶有門，便于飼料的投放。飼料為鮮嫩的禾本科植物，蝗蟲采食時間在早晨9∶00至下午5∶00，每天2～3次。

1.1.4 主要試劑 蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏(Oxoid, 美國)；苯甲基磺酰氟、聚乙二醇、巰基乙醇、乙酸銨、HCl、NaOH(Amresco，美國)；透析袋(Sigma，美國)。

1.1.5 主要儀器 超低溫冰箱 (美國 FORMA) ；低溫4 ℃離心機 (Legend Micro21，美國Thermo公司)；自動滅菌鍋(SANYO日本三洋)；高速組織勻漿機(德國BILON公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱 (成都電烘器廠)。

1.2 方 法

1.2.1 抗菌活性物質粗提物的制備 東亞飛蝗成蟲針刺腹部，浸泡在處于對數(shù)生長期(3×108CFU/mL)的大腸桿菌菌懸液中10 min，分別飼養(yǎng)24、48、72 h后，收集蟲體，與沒有刺激浸泡的蟲體，分為四組于-80 ℃冷凍過夜。取出放入高速組織勻漿機中搗碎成漿糊狀，按重量/體積比為1∶3加入提取液(0.05 mol/L 乙酸銨緩沖液、35 μg/mL PMSF、2 % 巰基乙醇)，充分搗碎，勻漿液用400目紗網過濾，濾液4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，沉淀再用0.05 mol/L 乙酸銨緩沖液浸泡后冷凍離心，重復三次，合并上清液。將上清液在沸水浴中攪拌加熱5 min，迅速在冰浴中冷卻后，經4 800 r/min離心30 min除去變性蛋白，沉淀再用少量蒸餾水洗滌兩次，以同樣轉速離心30 min，合并三次上清液，放于潔凈樣品瓶內加蓋，-80 ℃保存。

1.2.2 抗菌活性物質粗提物活性篩選 分別測定無刺激以及刺激后飼養(yǎng)24、48、72 h提取的抗菌活性物質粗提物的抑菌活性。在每個消毒培養(yǎng)皿(直徑，9 cm)中將14 mL經高壓滅菌冷卻至50 ℃的固體培養(yǎng)基與200 μL的對數(shù)生長期的菌液快速混合均勻，待冷凝后，在培養(yǎng)皿中等距離加入兩個牛津杯，分別在牛津杯中加入150 μL的蝗蟲粗提液，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中，適當溫度下培養(yǎng)，測量并記錄透明區(qū)域直徑大小來表示抑菌作用大小。

1.2.3 抗菌活性物質粗提物的純化 參照陸健等采用的方法[6]，將上述抑菌效果最好的一組粗提物裝入透析袋內，排出袋中空氣，封住袋子另一端，將透析袋包埋于10倍于蛋白質樣品體積的裝有20%聚乙二醇溶液的容器中，在4 ℃，電磁攪拌器緩慢攪拌至達到所需濃度。一方面將樣本中保留的小分子蛋白質和多肽進一步得到濃縮，另一方面又除去了緩沖液中的尿素和鹽類，使小分子蛋白質和多肽得到了進一步純化。將透析濃縮的樣品再次在4 ℃下， 12 000 r/min離心30 min，將沉淀的蛋白質及少量的脂肪除去，取上清液-80 ℃保存，即為純化的抗菌活性物質。

1.2.4 純化抗菌活性物質對細菌的抑菌效應 分別比較抗菌活性物質對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及水稻白葉枯病原菌的抑菌活性，采用國際通用抗生素效價測定方法即杯碟法，測定抑菌圈直徑，每種菌種3次平行。將菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中在恒溫搖床中37 ℃培養(yǎng)6 h，然后將培養(yǎng)液稀釋成106 個/mL的菌液。取500 μL的菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基制成平板中，放上4個牛津杯，分別加上200 μL的樣品液，200 μL的蒸餾水作為陰性對照，最后一個則不加任何物質作為空白對照。然后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第二天觀察記錄抑菌效果。

1.2.5 抗菌活性物質濃度測定 依照紫外吸收法[7]取純化后的抗菌活性物質溶液50 μL，用蒸餾水稀釋，分別在280 nm、260 nm處測定吸收值，按下式計算蛋白濃度(mg/mL)。

c=(1.45 A280-0.74 A260)×稀釋倍數(shù)

式中：c為抗菌活性物質原始濃度(mg/mL)；A280為蛋白溶液在280 nm處測得的吸光度；A260為蛋白溶液在260 nm處測得的吸光度。

1.2.6 抗菌活性物質收率測定 東亞飛蝗抗菌活性物質收率測定用鄒鋒采用的方法[8]。

蝗蟲抗菌活性物質收率=c·V/m×100%

式中：c為抗菌活性物質濾液濃度(mg/mL)；V為濾液體積(mL)；m為蝗蟲質量(g)。

2 結 果

2.1 抗菌活性物質粗提物的萃取

三組刺激后的東亞飛蝗與未經誘導的一組東亞飛蝗，每組10只，去除腿與翅膀后，經過組織勻漿，每組各得到16 mL左右的勻漿液，經處理純化后得到粗提物13 mL，各組取3 mL做抑菌試驗。

2.2 粗提物抗菌活性的篩選

本試驗中，無刺激以及刺激后飼養(yǎng)24 h、48 h和72 h不同處理條件下的東亞飛蝗抗菌活性物質粗提液均有一定的抑菌活性(圖1)。圖1結果顯示，未刺激與刺激后飼養(yǎng)72 h的兩組東亞飛蝗抗菌活性物質粗提液抑菌活性效果不明顯；針刺腹部，浸泡大腸桿菌后飼養(yǎng)48 h的東亞飛蝗抗菌活性物質粗提液抑菌活性明顯高于對照和刺激后飼養(yǎng)72 h的抗菌活性物質粗提液；針刺腹部，浸泡大腸桿菌后飼養(yǎng)24 h的東亞飛蝗抗菌活性物質粗提液抑菌活性在四組中最高。

圖1 四組不同處理條件下東亞飛蝗抗菌活性物質粗提液抑菌效果Fig.1 Bacteriostasis effects of Asiatic migratory locust antibacterialactivity materials extract liquid in different treatment conditions

A.正常飼養(yǎng)未經針刺腹部、浸泡大腸桿菌懸液的蝗蟲粗提液；B.針刺腹部、浸泡大腸桿菌菌懸液，飼養(yǎng)24 h后蝗蟲粗提液；C.針刺腹部、浸泡大腸桿菌菌懸液，飼養(yǎng)48 h后蝗蟲粗提液；D.針刺腹部、浸泡大腸桿菌菌懸液，飼養(yǎng)72 h后蝗蟲粗提液

Noet:A.The locusts crude extracts of normal feeding without needle abdomen, soakE.colisuspension;B.The locusts crude extracts of abdomen was needled and soakE.colibacterial suspension then feeding 24 h ;C.The locusts crude extracts of abdomen was needled and soakE.colibacterial suspension then feeding 48 h; D.The locusts crude extracts of abdomen was needled and soakE.colibacterial suspension then feeding 72 h

2.3 抗菌活性物質粗提物的純化結果

將上述抑菌效果最好一組，即針刺腹部、浸泡大腸桿菌菌懸液飼養(yǎng)24 h后的東亞飛蝗抗菌活性物質粗提液透析過夜，透析濃縮后再次置于4 ℃下，12 000 r/min 離心30 min，檢測其對金黃色葡萄球菌抑菌活性，如圖2所示。

圖2 純化的蝗蟲抗菌活性物質提取液抑菌效果A.純化前粗提液；B. 純化后粗提液Fig.2 Bacteriostasis effects of purified Asiatic migratory Locust antibacterial activity materials extract liquidA.crude extract before purified;B.crude extract liquid after purified

2.4 抗菌譜的測定

東亞飛蝗抗菌活性物質粗提液對革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)或對革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、水稻白葉枯病原菌)均有一定的抑制作用，其抗菌譜為:金黃色葡萄球>水稻白葉枯病原菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌(見圖3)，其中以對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯(見圖4)。

2.5 抗菌活性物質的濃度

東亞飛蝗抗菌活性物質的濃度c=(1.45A280-0.74A260)×稀釋倍數(shù)=(1.45×2.092-0.74×2.507)×10=11.782 mg/mL

圖3 東亞飛蝗抗菌活性物質對細菌的抗菌譜

Fig.3 Antibacterial activity spectrum of antibacterial sub-stances of oriental migratory locust on bacterial

-.無活性(inactive);+.5.0～10 mm; ++.10.0～15 mm; +++.15.0～20 mm;++++.20.0～25 mm

2.6 抗菌活性物質的收率

蝗蟲抗菌活性物質收率=c·V/m×100 %=11.782×69.6÷9509.35=8.623%

圖4 東亞飛蝗粗提物對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的抑菌效果Fig.4 Bacteriostasis effects of Asiatic migratory locust antibacterial activity materials extract liquid in gram-positive bacteria and gram-negative bacteriaA.大腸桿菌；B.金黃色葡萄球菌；C.水稻白葉枯病原菌；D.枯草芽孢桿菌A. E. coli bacteria;B.Staphylococcus aureus;C. Original rice bacterial blight bacteria;D.Bacillus subtilis

3 討 論

20世紀60年代，人們開始重視昆蟲免疫的研究。但目前國內外對昆蟲抗菌活性物質的研究主要集中在果蠅、家蠶、蜜蜂、粉紋夜蛾等基礎研究上，對東亞飛蝗抗菌肽類物質的提取、功能、體外表達及活性檢測的研究鮮見報道。云南地處中國西部地區(qū)，對蝗蟲物種多樣性的研究比較全面、深入，蝗蟲資源基本清楚。東亞飛蝗屬昆蟲綱，直翅目，蝗科昆蟲，雌雄異體，成蟲后善跳、善飛。主要采食禾本科與莎草科植物，喜食的農作物主要有玉米、谷子等禾本科植物，是我國重要的農業(yè)蝗蟲[9]。本研究以東亞飛蝗為試驗材料，萃取抗菌活性物質和研究抑菌效應，為進一步研究東亞飛蝗新型抗菌肽積累基礎試驗數(shù)據(jù)。

昆蟲免疫系統(tǒng)具有對外源物質的免疫應答能力，一些外源物質或因素均能誘導昆蟲產生抗菌活性物質。昆蟲在機體受到損傷時，會產生抗菌肽，平時也會在表皮、口腔、腸道和生殖道等不同部位表達產生一定量抗菌肽，使共生的自然菌落處于穩(wěn)定狀態(tài)[10-11]，與本試驗研究結果一致，即沒有針刺蘸大腸桿菌誘導的東亞飛蝗粗提液也能產生抗菌作用，表明東亞飛蝗血淋巴中抗菌活性物質的產生可能受某種基因的調控。本試驗結果顯示，針刺蝗蟲腹部，浸泡在大腸桿菌菌懸液中能顯著提高蝗蟲粗提液的抑菌效果，其中針刺蝗蟲腹部后飼養(yǎng)24 h抑菌活性最強。

昆蟲抗菌活性物質對細菌的作用主要是破壞細胞膜，通過具有α-螺旋結構的雙親性蛋白質改變細菌質膜的滲透性發(fā)揮作用，不同于青霉素等抗生素是阻斷大分子生物合成的抗菌機制，故不易產生耐藥性。本試驗通過牛津杯法證明，此類萃取物對臨床多重耐藥的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定抑制作用，其中對革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌抑制效果最好，對其它幾種臨床多重耐藥菌也有一定的抑制作用。研究表明，Moricin(絲蠶抗菌肽)對大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等13種細菌均有明顯的抑制作用，而且它們的最小致死濃度均低于0.9 μM[12]，與本試驗結果基本一致。邱曉燕[13]從舍蠅幼蟲中提取的抗菌肽可抑制金黃色葡萄球菌生長，但是對大腸桿菌、綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌均無抑制作用。而趙立蘋[14]初步分離稻蝗抗菌肽對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌沒有抑制效果，其原因可能與蝗蟲品種及飼養(yǎng)條件有關。

將蝗蟲萃取物置于100 ℃水浴鍋及-80 ℃不同溫度下，對其活性影響不大，證明其具有一定的耐熱耐寒穩(wěn)定性，具有較大研發(fā)和應用潛力。黨向利[15]從誘導的家蠅蛹的粗提液中分離純化出了4種抗菌物質，即3個抗菌肽和1個抗菌化合物。3個抗菌肽分別是分子量為11992.48 Da的IA,家蠅defensin和分子量為7 988.43 Da的IIB。應用RT-PCR技術對4種抗菌肽/蛋白基因在家蠅蛹內表達進行了研究，明確了家蠅蛹體內cecropin、defensin和attacin等抗菌肽的表達是誘導型的，而lysozyme是組成型表達。應用生物信息學方法，證實了家蠅defensin具有典型的昆蟲防御素空間構象，即αββ結構。駱雪等[16]研究表明，東亞飛蝗抗菌活性物質可成功誘導LPS刺激豬免疫應激細胞β-defensins-1(pBD-1)，pBD-2和pBD-3基因表達上調，結果為改善動物抗病能力提供了有效途徑。結合本試驗結果，提示東亞飛蝗提取的抗菌活性物質可能治療某些細菌性疾病，而且不易產生耐藥性，這是抗生素替代品未來研究發(fā)展的一個重要方向。在本試驗基礎上，進一步研究東亞飛蝗抗菌活性物質的抗菌譜與最小抑菌濃度，研究東亞飛蝗抗菌肽的抗病作用機理，可成功誘導機體抗病基因的表達，改善機體免疫性能和提高抗病能力。

4 結 論

針刺誘導東亞飛蝗成蟲和飼養(yǎng)不同時間后提取液的抑菌活性具有明顯差別，東亞飛蝗成蟲提取液對革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌均有抑制作用，其抗菌譜為:金黃色葡萄球>水稻白葉枯病原菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌，其中以針刺誘導飼養(yǎng)24 h后的抑菌效果最明顯，東亞飛蝗抗菌活性物質粗提液經純化后增強抑菌效果。結果提示：東亞飛蝗體內含有抗菌活性物質，具有可誘導性，但其抗菌作用機理有待進一步研究。

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