付冬麗，楊廣禮，代燎原， 羅玉柱

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 商丘師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000)

動物毛色遺傳研究是動物表型變化遺傳機(jī)理研究的最好模型[1]。目前實驗小鼠內(nèi)存在378個與毛色相關(guān)的遺傳座位，171個毛色功能基因已經(jīng)被克隆鑒別[2]。這些基因以不同路徑單獨或聯(lián)合影響著動物色素細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和遷移等過程，還影響著色素細(xì)胞分泌黑色素的合成、轉(zhuǎn)運和分布，最終影響動物表型毛色和羽毛[1]。而這些基因的編碼區(qū)域和調(diào)控序列引起的突變，如SNP、復(fù)制、插入和缺失，對動物的毛色變異都有可能起主要作用。動物的毛色表型性狀受其體內(nèi)所存在的兩種黑色素前體物質(zhì)：真黑色素和偽黑色素所控制[3]。Agouti基因(ASIP)編碼的是一類旁分泌信號蛋白分子，作為MC1R基因的配基，來抑制MC1R的信號。它們的比率基本上受ASIP和MC1R配合受體系統(tǒng)控制。MCIR基因突變使其失去功能，動物的基本毛色為黃色(偽黑素占優(yōu))，而MCIR基因功能的獲得或ASIP基因突變使其功能喪失，動物的毛色為黑色(真黑素占優(yōu))。

ASIP基因結(jié)構(gòu)在哺乳動物內(nèi)具有很高的保守性，包括鼠、人、馬、豬、牛和犬[4-9]。小鼠基因組的插入或刪除變異會影響ASIP及其鄰近座位ASIP基因表達(dá)調(diào)控的解除，引起黃色素的沉積、成年鼠肥胖、糖尿病、腫瘤生長和胚胎的死亡[10]。其它鼠ASIP編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)域的突變影響著ASIP的表達(dá)和功能，最終影響被毛色素沉積模式[11-12]。ASIP基因變異使其功能喪失，導(dǎo)致動物毛色的變異已經(jīng)在家養(yǎng)動物類群中發(fā)現(xiàn)，如犬屬動物、貓、豬、馬、老鼠和狐貍等[6，9，13-16]。同樣也在野生物種，如野馬和野綿羊中發(fā)現(xiàn)[17-18]。ASIP基因的表達(dá)在動物不同的組織部分及不同的發(fā)育時期存在很大的變異。如動物背腹部的毛色差異是由背腹部ASIP基因表達(dá)差異調(diào)控。然而，鳥類羽毛不同的毛色帶是由ASIP在羽毛不同的發(fā)育時期引起[19-22]。

野豬作為家豬的祖先，其馴養(yǎng)過程對野豬的形態(tài)、生理和行為改變起著重要的作用[22-24]。在這些變化中，與現(xiàn)代家豬和育成的商品豬相比，被毛的變化似乎是最明顯的一類。究其野豬和家豬之間的毛色變化的機(jī)理和原因仍然不是很清楚。因此，本研究選擇被毛顏色存在差異的野豬群體，通過直接測序法識別蘊(yùn)藏在這些野豬群體內(nèi)影響毛色差異的ASIP候選功能基因的突變位點及群體內(nèi)的多態(tài)性，結(jié)合群體遺傳學(xué)理論，闡明野豬群體內(nèi)及與商品豬、現(xiàn)代家養(yǎng)品種間影響毛色差異功能基因的遺傳機(jī)理，以此為基礎(chǔ)了解野豬群體遺傳多樣性來證明ASIP基因是否在野豬群體里面對毛色變化的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗樣品于2009年采自商丘市黃環(huán)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的野豬群體，選擇成年個體間沒有血緣關(guān)系的野豬72頭，分別采取每只豬的耳組織樣品約0.5 g左右，裝入事先準(zhǔn)備好含有75%的酒精溶液的EP管內(nèi)保存，然后帶回實驗室冷藏于-20 ℃冰箱，以供基因組DNA的提取。長白豬樣品于2006年采集天津?qū)幒头N豬場。72頭野豬按照圖1被毛顏色表型進(jìn)行分類。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 采用EasyPure Genomic DNA Extraction 試劑盒提取豬耳組織基因組DNA(北京，天根生物技術(shù)有限公司)，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，提取好的DNA經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后保存于-20 ℃冰箱，作為PCR擴(kuò)增的模板。

圖1 野豬群體和長白豬的被毛表型Fig. 1 Coat color phenotype in the wild boar population and landrace

1.2.2 引物設(shè)計 通過Ensemble網(wǎng)站(http://www.ensembl.org/index.html)獲取豬ASIP基因序列(ENSSSCT00000007962)，該序列含有ASIP基因5個外顯子、4個內(nèi)含子和5′側(cè)翼區(qū)(5′-UTR)、3′-UTR區(qū)域序列，通過Primer 5引物設(shè)計軟件，設(shè)計了5對包括5個外顯子、5′-UTR、3′-UTR和部分內(nèi)含子序列引物。所有引物由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成，引物名稱、序列、擴(kuò)增片段大小和最佳退火溫度見表1。

表1 引物名稱、引物序列、擴(kuò)增片段大小和最佳退火溫度Table 1 Primer name, primer sequence,optimal annealing temperatures(Tm) and amplicon sizes

1.2.3 SNPs的鑒別 為了有效的識別SNPs，分別選取被毛為黑色、棕黃色、銀棕色的野豬個體各5頭，混合成DNA池基因組，作為PCR擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增所用反應(yīng)體系為25 μL，其中含有50 ng模板DNA，ddH2O 18.5 μL，10 μmol·L-110×buffer 2.5 μL，25 mmol· L-1Mg2+1.5 μL， 10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL， 10 μmol· L-1引物各0.5 μL，2.5 U Taq酶。循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，各引物在退火溫度下(表1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下拍照，若出現(xiàn)明顯的目的條帶，收集PCR產(chǎn)物，直接送北京華大生物技術(shù)有限公司測序，然后用DNASTAR軟件進(jìn)行序列比對分析檢測突變位點。

1.2.4 SNPs與被毛表型相關(guān)性研究 所識別的SNPs突變位點，在沒有找到適宜的酶切位點情況下。重新設(shè)計引物(表1，ASIP-3′-UTR)，再次擴(kuò)增、純化及測序，用DNASTAR軟件分析判定72頭不同被毛表型的野豬群體和30頭長白豬群體內(nèi)的基因型，最后通過被毛表型記錄結(jié)果分析與基因型之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs的鑒別

以野豬被毛為黑色、棕黃色、銀棕色的個體各5頭提取的基因組DNA，各取5 μL混合成DNA池，用表1中的引物和退火溫度、材料和方法中的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對不同被毛顏色的混合池DNA為模板擴(kuò)增獲得每對引物預(yù)期的片段大小。若出現(xiàn)明亮的目的條帶(圖2)，收集PCR產(chǎn)物，直接送北京華大生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果由DNAStar軟件分析，分析結(jié)果表明，在ASIP基因的3′-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個T→C的突變位點(圖3)，而在其它區(qū)域沒用發(fā)現(xiàn)。該位點在ASIP基因cDNA序列的695位(ENSSS-CT00000007962 cDNA)，因此命名為ASIPc695T→C。這個結(jié)果與一些其他哺乳動物的結(jié)果很相似。如對非洲人黑色皮膚的研究中，在ASIP基因3′-UTR發(fā)現(xiàn)了 g 8818的A-G突變[25]。而基因的表達(dá)可以通過mRNAs轉(zhuǎn)錄后3′-UTR區(qū)域里面的元件調(diào)控。

圖2ASIP基因第5外顯子引物PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig. 2 Amplification results of fifth exon primer in porcineASIPgene
M.Marker DL 2000；C.對照;1-7.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
M.Marker;C.Control;1-7.PCR amplification product

圖3 ASIP基因3′-UTR c 695 T→C突變位點
Fig. 3 The c 695 T→C mutation site in the wild boar ASIP gene 3′-UTR

2.2 SNP突變位點基因型與被毛表型相關(guān)性

所識別的SNP突變位點，用ASIP-3′-UTR引物擴(kuò)增后(圖4)，通過直接測序，在72頭不同被毛表型的野豬群體和30頭長白豬群體內(nèi)進(jìn)行基因型判定，結(jié)果見表2。所有野豬個體里面出現(xiàn)CC或CT兩種基因型，而長白豬群體里面只出現(xiàn)了TT基因型。等位基因C是野豬群體里面的優(yōu)勢等位基因。7個不同毛色類群的野豬群體里面，都存在CC和CT兩種基因型，也就是說，ASIP基因3′-UTR c.695 T→C的突變，可能影響著與長白豬白色被毛不同的其他被毛表型，也有可能還有其他毛色功能基因參與野豬毛色的形成。

圖 4 ASIP基因3′-UTR引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of 3′-UTR primer in porcine ASIP geneM.Marker DL 2000;C.對照;1-7.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.Marker;C.Control;1-7.PCR amplification product

3 討 論

野仔豬從出生到成年，保幼帶隨著仔豬的生長到6月齡時就會消失，到成年時呈現(xiàn)出灰色或褐色被毛。野豬長期的自然選擇引起野豬群體多樣性的被毛變成，包括黑色、白色、棕黃色、灰色、紅棕色、黑棕色、棕黒色、銀棕色、灰棕色等色素類型。在多數(shù)野豬群體內(nèi)，所有的豬群享有相同的毛色模式，野生型作為品種的特征。但是，在大多數(shù)野豬群體內(nèi)這種野生型的毛色也存在以上被毛顏色的變異，可能有不同的毛色功能基因調(diào)控。本研究以野豬被毛為黑色、棕黃色、銀棕色的個體各5頭提取的基因組DNA混合成的DNA池為PCR擴(kuò)增模板，以ASIP基因的5對引物進(jìn)行擴(kuò)增、純化和測序，只在ASIP基因的3′-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個T→C的突變位點，而在其他區(qū)域沒用發(fā)現(xiàn)。這個結(jié)果與一些其它哺乳動物的結(jié)果很相似。如對非洲人黑色皮膚的研究中，在ASIP基因3′-UTR發(fā)現(xiàn)了g.8818的A-G突變[25]。而基因的表達(dá)可以通過mRNAs轉(zhuǎn)錄后3′-UTR區(qū)域里面的元件調(diào)控。要確定ASIP基因3′-UTR區(qū)域里面的T→C堿基突變是否影響野豬的不同毛色類型。我們在72頭不同被毛表型的野豬群體和30頭長白豬群體內(nèi)進(jìn)行基因型判定，所有野豬個體里面出現(xiàn)CC和CT兩種基因型，而長白豬群體里面只出現(xiàn)了TT基因型。等位基因C是野豬群體里面的優(yōu)勢等位基因。7個不同毛色類群的野豬群體里面，都存在CC和CT兩種基因型，也就是說，ASIP基因3′-UTR c.695 T→C的突變，可能影響著不同與長白豬白色被毛的其他被毛表型，也有可能還有其它毛色功能基因參與野豬毛色的形成。野豬被毛顏色相比于商品豬、其他地方家豬存在的差異，所能做出的解釋有如下幾點：野生型動物沒有經(jīng)過人為的特異性選擇，其次一些突變影響野生動物被毛的形成，而有些性狀受到強(qiáng)有力的選擇，或者是根據(jù)人類的愛好和需要經(jīng)過選擇來轉(zhuǎn)變動物被毛的表型。野豬群體里面存在野生狀態(tài)下的超純選擇維持著野豬的偽裝被毛，也就是說某一功能基因雖然在野豬群體內(nèi)存在突變，很難找到某一突變位點與其某一毛色存在強(qiáng)相關(guān)性。

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