牛惠然，字向東* ，任 陶，王 永，任稱羅爾日，朱萬嶺，付錫三

(1.西南民族大學(xué)，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.四川省理縣畜牧局，四川 理縣 623100；3.四川省樂至縣科技局，四川 樂至 641500)

正常細(xì)胞受到熱刺激能引起熱休克基因編碼的熱休克蛋白家族(HSP)的快速增殖和表達(dá)。不同的熱休克蛋白家族成員依據(jù)其分子大小和在細(xì)胞中執(zhí)行的功能進(jìn)行分類。HSP90家族能與類固醇受體結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1]，HSP70家族是蛋白質(zhì)遷移和折疊的必需元件[2-3]，HSP60家族對于維持折疊后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是非常重要的[4]。HSP家族已經(jīng)被證實(shí)在魚受到外界過冷、過熱溫度刺激時(shí)會出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，而這對于維持正常的免疫功能來說是至關(guān)重要的[5-6]。在已知的所有HSP家族中，HSP70作為感受壓力的生物標(biāo)記得到了較廣泛的研究[7]。而誘導(dǎo)HSP70表達(dá)上調(diào)最主要的事件就是細(xì)胞遭到損害[8]。HSP70家族包括四類蛋白質(zhì)：HSP73、HSP72、GRP75和GRP78。HSP73被稱為HSP70同源蛋白(HSC70)，主要由組成型或稱同源型的基因(HSC70)編碼，HSP72屬誘導(dǎo)性HSP70，HSP70.1是編碼它的主要基因之一，這兩個(gè)基因編碼的HSP73和HSP72作為分子伴侶在細(xì)胞中起著關(guān)鍵性作用。當(dāng)細(xì)胞暴露在各種極端壓力環(huán)境中時(shí)，HSC70基因的表達(dá)量基本保持不變或者僅有輕微的上升，而HSP70.1基因卻會被高度誘導(dǎo)表達(dá)。這一反應(yīng)過程從低代謝表達(dá)水平時(shí)就開始啟動(dòng)，通過由HSF1基因編碼的熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF1)的介導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄控制元件結(jié)合為一個(gè)三聚體形式的HSP70的基因啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)反應(yīng)[9]。

樂至黑山羊經(jīng)長期選育而成，具有前期生長發(fā)育快、產(chǎn)肉性能好、產(chǎn)羔率高等優(yōu)點(diǎn)，主要分布在低海拔、夏季炎熱的樂至縣及其周邊地區(qū)，是一種優(yōu)良的地方山羊品種[10]。藏山羊以盛產(chǎn)山羊絨久負(fù)盛名，主要分布在高海拔、低溫、缺氧的青藏高原，是當(dāng)?shù)啬撩癫豢苫蛉钡慕?jīng)濟(jì)型家畜[11]。HSP70家族成員能依據(jù)機(jī)體組織所處環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)，但是HSC70、HSP70.1以及HSF1等與抗性相關(guān)的熱休克基因在哺乳動(dòng)物中研究較少，本研究擬利用熒光定量PCR技術(shù)探討HSC70、HSP70.1和HSF1基因在樂至黑山羊和藏山羊心臟、肝臟、卵巢、子宮、腦垂體等5個(gè)組織中的表達(dá)變化，以期篩選有用的生物標(biāo)記及為實(shí)現(xiàn)應(yīng)用標(biāo)記輔助選擇山羊的生態(tài)適應(yīng)性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

試驗(yàn)動(dòng)物為樂至黑山羊和藏山羊。在四川省樂至縣天龍科技示范園隨機(jī)選取6只3～5歲健康的舍飼成年樂至黑山羊母羊，當(dāng)?shù)睾０?96 m，經(jīng)緯度為30°30′N105°02′E。采樣時(shí)間為8月中旬，此時(shí)日均溫度31 ℃。在理縣藏山羊養(yǎng)殖農(nóng)戶隨機(jī)選取6只3～5歲健康的放牧藏山羊。海拔2 800 m左右，經(jīng)緯度為31°43′N103°17′E。采樣時(shí)間為9月中旬，日平均氣溫20℃。屠宰后，取其肝臟、心臟、卵巢、子宮、腦垂體等組織樣，用生理鹽水清洗后，迅速投入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

從液氮中取出組織樣，用高溫處理過的剪子迅速剪下約20 mg組織，用天根公司的RNA提取試劑盒提取出樂至黑山羊和藏山羊的總RNA。

分別取6 μL mRNA溶液、1 μL Oligo (dT)18Primer、4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL RiboLockTMRNase Inhibitor (20 U/μL)、2 μL 10mM dNTP Mix、1 μL RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase (200 U/μL) 混合，DEPC-treated water補(bǔ)足至20 μL后加入到200 μL RNase-free EP管中，混勻并離心；將該EP管置于PCR儀中，42 ℃恒溫60 min，70 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，即得cDNA， -20 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 qPCR引物設(shè)計(jì)及特異性檢測

根據(jù)GenBank中山羊HSC70、HSP70.1、HSF1和β-Actin序列，用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)上述基因的定量上下游引物，送Invitrogen上海公司合成。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。

qPCR反應(yīng)體系為10 μL：上下游引物各1 μL(2 μmol/L)，SsoFastTMEvaGreen Supermix 5 μL，ddH2O 2.5 μL，模板cDNA 0.5μL。

qPCR反應(yīng)條件：反應(yīng)在Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，采用GCS八連管及蓋子。95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃/10 s、58 ℃/20 s 45個(gè)循環(huán)。從65 ℃到95 ℃，每5 s升高0.5 ℃，收集熒光信號，繪制融解曲線，分析產(chǎn)物的特異性。為減小誤差，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)，并設(shè)置三個(gè)無模板的空白管作為對照，以平均值參與數(shù)據(jù)分析。

表1 定量引物序列Table1 Primer pairs for qPCR

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

qPCR所得數(shù)據(jù)利用2-△△CT方法計(jì)算后，再采用t-檢驗(yàn)：雙樣本等方差假設(shè)分析HSC70、HSF1以及HSP70.1基因在樂至黑山羊和藏山羊各組織中的相對表達(dá)量倍比關(guān)系。

2 結(jié) 果

在本試驗(yàn)中通過對HSC70、HSF1和HSP70.1基因在樂至黑山羊和藏山羊5個(gè)組織中的mRNA表達(dá)量的分析，結(jié)果表明：HSC70 mRNA在藏山羊心臟中的表達(dá)量是樂至黑山羊的4.5倍，差異顯著 (P<0.05)，在腦垂體中樂至黑山羊的表達(dá)量是藏山羊的3.7倍，差異顯著(P<0.05)，而在卵巢、肝臟、子宮中兩品種間無顯著差異(圖1)。HSF1 mRNA在藏山羊卵巢、心臟中的表達(dá)量分別是樂至黑山羊的7.9和3.1倍，差異顯著(P<0.05)，但是在肝臟、子宮這兩個(gè)組織樣中卻是樂至黑山羊表達(dá)量的高，分別為藏山羊的6.3倍和10.4倍(P<0.05;圖2)。HSP70.1 mRNA在兩種山羊的卵巢、肝臟、子宮和心臟中的表達(dá)量無顯著差異，在腦垂體中樂至黑山羊是藏山羊的6.8倍，差異顯著(P<0.05;圖3)。

3 討 論

圖1HSC70基因在不同組織中的相對表達(dá)量(Mean±SE)
a.代表差異顯著(P<0.05)。下同。
Fig. 1 Relative mRNA expression of HSC70 in five tissues
a.significant difference (P<0.05).The some below.

圖2HSF1基因在不同組織中的相對表達(dá)量(Mean±SE)
Fig. 2 Relative mRNA expression of HSF1 in five tissues

圖3 HSP70.1基因在不同組織中的相對表達(dá)量(Mean±SE)Fig. 3 Relative mRNA expression of HSP70.1 in five tissues

HSP是一類幾乎在所有生物的細(xì)胞中遭受刺激后都能被高度誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)，它具有在極端條件下依舊維持自身機(jī)體正常運(yùn)行的功能。其中，HSP70被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞HSP中最重要的，它主要與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)相互作用，防止它們聚合在一起，發(fā)生細(xì)胞毒性反應(yīng)[12-13]。Buckley等[14]在評價(jià)蝦虎魚的細(xì)胞對熱應(yīng)激的反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)作為分子伴侶的HSP70是轉(zhuǎn)錄作用中較敏感的一類基因，它們具有組織特異性。本試驗(yàn)的研究結(jié)果也表明HSC70、HSF1和HSP70.1基因在樂至黑山羊或藏山羊的肝臟、子宮、腦垂體、心臟和卵巢等5個(gè)組織樣中的表達(dá)不盡相同。

本研究中的樂至黑山羊采樣于八月中旬，此時(shí)樂至縣的日均氣溫達(dá)31 ℃，肝臟細(xì)胞持續(xù)處于高溫造成的應(yīng)激狀態(tài)，對肝臟組織中的自由基代謝和抗氧化酶的影響較明顯[15]。大量研究表明HSP70參與細(xì)胞的保護(hù)作用，以抵抗高溫等造成的損傷，否則持續(xù)處于高溫天氣造成的熱應(yīng)激將會直接導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或壞死[16]。正常情況下HSP70處于基礎(chǔ)表達(dá)水平，但處在高溫這種有害應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)變性蛋白水平會升高，HSP70通過與變性蛋白結(jié)合大量釋放HSF1，HSF1再在磷酸激酶的作用下與熱休克元件(HSE)結(jié)合，從而啟動(dòng)HSP70基因的轉(zhuǎn)錄使熱休克蛋白大量表達(dá)來抑制應(yīng)激，保護(hù)肝臟細(xì)胞[1,17]。圖2顯示，與HSP70表達(dá)相關(guān)的HSF1基因在樂至黑山羊中的表達(dá)量確實(shí)顯著高于同期在日均溫度為20 ℃理縣飼養(yǎng)的藏山羊。

近年來，越來越多的研究還集中在HSP70對心臟等的保護(hù)機(jī)制中。Liu等[18]研究結(jié)果表明，HSP70可通過調(diào)節(jié)Ca2+通道內(nèi)環(huán)境，對心肌起保護(hù)作用，使心臟在極端環(huán)境下仍能正常行使功能。HSP70也可通過保護(hù)心肌上的線粒體，使其保障心肌細(xì)胞正常的能量代謝，從而緩解心臟因缺血造成的再灌注損傷[19]。HSP70還能直接行使抗氧化作用保護(hù)心臟[20]。而HSP70的表達(dá)量直接受HSC70、HSF1和HSP70.1這三個(gè)基因相對表達(dá)量的影響。本研究中，樂至黑山羊是舍飼，而藏山羊是被放牧在高海拔、低氧、陡峭的山坡上，在這種環(huán)境下的放牧運(yùn)動(dòng)必然導(dǎo)致藏山羊心臟承受極大的壓力。因此，藏山羊心臟中HSC70和HSF1基因的表達(dá)量顯著高于樂至黑山羊，說明放牧的藏山羊通過調(diào)高心臟中HSC70和HSF1基因的表達(dá)量來維持其正常的生理功能，與以上理論相符。

本研究還發(fā)現(xiàn)在生殖軸樂至黑山羊垂體中HSC70 和HSP70.1基因的表達(dá)量以及子宮中HSF1基因的表達(dá)量都高于藏山羊，而藏山羊卵巢中HSF1基因的表達(dá)量顯著高于樂至黑山羊，這種復(fù)雜的基因表達(dá)差異是否最終導(dǎo)致兩個(gè)品種產(chǎn)羔率的差異有待進(jìn)一步研究。

該研究結(jié)果初步揭示了HSC70、HSF1和HSP70.1基因在樂至黑山羊和藏山羊兩個(gè)不同生態(tài)類型的山羊品種間的表達(dá)差異，這種差異可能與所處的生態(tài)環(huán)境和放牧運(yùn)動(dòng)有一定的關(guān)系。研究成果為深入研究山羊的生態(tài)適應(yīng)性，以及選育抗逆山羊品種奠定了一定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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