韓 波， 張立民， 陳立鋒， 趙自剛， 李曙光△， 牛春雨△

(1河北北方學院微循環(huán)研究所，河北張家口075029;2內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000)

肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，在機體新陳代謝中發(fā)揮重要作用。創(chuàng)傷、失血、內(nèi)毒素等嚴重致病因素引起的肝損傷，成為多器官衰竭發(fā)生的重要環(huán)節(jié)［1-4］。近年來，學者們開始關(guān)注淋巴系統(tǒng)與危重病發(fā)病機制的關(guān)系，認為危重狀態(tài)下的腸淋巴液回流是導致機體重要器官結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙的關(guān)鍵因素［5-6］。我們的研究也表明，阻斷腸淋巴液回流可減輕失血－脂多糖、重癥失血性休克大鼠肝臟的組織學損傷［7-9］，其機制還有待深入研究。研究表明，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)作為一種內(nèi)源性氣體分子，在炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導、能量代謝、細胞增殖與凋亡、氧化還原狀態(tài)等方面具有多種生物學活性［10］，參與了失血性休克和內(nèi)毒素休克后的炎癥反應(yīng)以及器官損傷［11-12］。H2S引起的炎癥反應(yīng)是否與腸淋巴液回流導致的肝細胞損傷有關(guān)，國內(nèi)外尚無詳細的報道。為此，本研究應(yīng)用H2S合成酶胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)抑制劑 DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PPG)和 H2S供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)作用于行腸淋巴液引流的大鼠，探討H2S在腸淋巴液引流減輕休克大鼠肝損傷中的作用，結(jié)合Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、白細胞介素(interleukin，IL)-10、IL-12 和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)的變化，探討其作用機制。

材料和方法

1 動物與處理

30只健康、清潔級Wistar雄性大鼠，購自中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心［動物許可證號為SCXK(軍)2007-004］，體質(zhì)量220～260 g。大鼠經(jīng)過1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機均分為:假手術(shù)組(sham)、休克組(shock)、休克+引流組(shock+drainage)、休克+引流+PPG組(shock+drainage+PPG)和休克+引流+NaHS組(shock+drainage+NaHS)。動物在實驗前禁食12 h，自由飲水。休克+引流+PPG組大鼠于放血前0．5 h腹腔注射 PPG(Sigma，45 g/L，45 mg/kg)，休克+引流+NaHS組大鼠于放血前0．5 h腹腔注射 NaHS(Sigma，28 mmol/L，28 μmol/kg)，PPG和NaHS所用劑量參考文獻［13-14］;假手術(shù)組、休克組和休克+引流組大鼠于放血前0．5 h或相當時點腹腔注射與另外2組等量的生理鹽水(1 mL/kg)。實驗過程中動物處置符合動物倫理學標準。

2 復(fù)制失血性休克模型

大鼠經(jīng)乙醚誘導麻醉后，肌肉注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg，德國/北京化學試劑公司分裝)全身麻醉，休克組、休克+引流組、休克+引流+PPG組和休克+引流+NaHS組大鼠復(fù)制失血性休克模型［15-16］:(1)股部手術(shù)，分離股靜脈和股動脈，右側(cè)股靜脈注射肝素鈉(1 mL/kg，500 U/kg)全身抗凝后，連接WZF-250F2型輸液泵(浙大醫(yī)學儀器有限公司)，備輸液;右側(cè)股動脈插管連接RM6240 BD型生物信號采集系統(tǒng)(成都儀器廠)監(jiān)測平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP);左側(cè)股動脈連接 NE-1000型抽注機(New Era Pump Systems)，備放血;(2)腹部正中線作長4 cm縱切口，打開腹腔，輕輕推開腸管，暴露腸系膜根部，游離腸系膜上動脈，仔細分離與腸系膜上動脈相伴行的腸淋巴管;(3)術(shù)畢穩(wěn)定30 min后，自股動脈勻速放血至40 mmHg，10 min完成;實驗過程中，以調(diào)整放血量維持血壓在(40±2)mmHg水平，60 min;(4)通過股靜脈緩慢回輸放出血液及林格氏液(1∶1)，30 min完成;(5)休克+引流組、休克+引流+PPG組和休克+引流+NaHS組在低血壓60 min、輸液30 min結(jié)束后，用一次性采血針插入腸淋巴管，引流腸淋巴液。休克組動物僅剝離腸淋巴管，假手術(shù)組動物僅進行相同的手術(shù)操作，但不放血，不輸液，不引流腸淋巴液，觀察至與其它各組相對應(yīng)的時點。各組大鼠在輸液結(jié)束后3 h或相應(yīng)時點，經(jīng)腹主動脈取血，留取大鼠肝臟，用于下述指標的檢測。

3 檢測血漿生化指標

應(yīng)用7600-110型全自動生化分析儀(日立)，采用速率法檢測血漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和總膽汁酸(total bile acid，TBA)。

4 觀察肝組織形態(tài)

選擇固定位置肝組織，以4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，常規(guī)方法制備組織切片，光鏡下觀察肝臟組織學變化，并拍片。

5 檢測肝組織H 2S含量

用不同濃度的NaHS標準液繪制標準曲線，其直線回歸方程為:y=1532．5x+6．786，R2=0．995。選擇固定位置肝組織，常規(guī)方法制備10%組織勻漿，檢測H2S含量:在玻璃試管中加入10 g/L醋酸鋅0．5 mL后，加入肝勻漿0．1 mL，振蕩搖勻，再依次加入20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽0．5 mL和30 mmol/L三氯化鐵0．5 mL，室溫孵育20 min，再加入1 mL 10%三氯醋酸使蛋白沉淀，最后以蒸餾水補足5 mL，充分混勻后，6 000 r/min離心5 min，吸上清液，用722分光光度計在670 nm波長處測其吸光度，應(yīng)用H2S標準曲線計算H2S含量(μmol/L)。考馬斯亮藍法定量肝勻漿總蛋白，肝勻漿H2S含量以μmol/(g protein)表示。

6 檢測肝組織CSE含量

應(yīng)用ELISA檢測試劑盒(抗體由R＆D生產(chǎn)、江蘇鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司合成)，繪制標準曲線(y=0．227x －0．028x2+0．003x3，R2=0．9987)后，嚴格按照試劑盒說明書，檢測各組肝組織勻漿CSE的含量。

7 檢測肝組織炎癥因子含量

應(yīng)用ELISA法檢測 TLR4、IL-10、IL-12和 TNF-α。TLR4標準曲線為:y=0.058x+0.005x2+0.00021x3，R2=0.9958;IL-10標準曲線為:y=0.025x+0.0004x2－ 0.00000083x3，R2=0.9989;IL-12 標準曲線為:y=0.023x+0.003x2－0.00004x3，R2=0.9986;TNF-α標準曲線為:y=1.003x+0.0001x2+0.00000032x3，R2=0.9991。

8 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件包處理。首先進行方差齊性檢驗，方差齊(P＞0．10)的資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，方差不齊(P≤0.10)的資料采用Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠肝組織H 2S含量的變化

休克組大鼠肝組織H2S含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01);休克+引流組大鼠肝組織H2S含量與休克組相比出現(xiàn)了下降的趨勢，有顯著差異(P＜0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.01);加入PPG的休克+引流+PPG組大鼠肝組織H2S含量顯著下降，低于休克組與休克+引流組(P＜0.05或P＜0.01);而加入NaHS的休克+引流+NaHS組大鼠肝組織H2S含量顯著高于假手術(shù)組和休克+引流組(P ＜0.05，P ＜0.01)，達到休克組水平，見圖1。

Figure 1．Changes of hydrogen sulfide(H2 S)in rat liver tissues．Mean ± SD．n=6．＊＊P ＜ 0.01 vs sham group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs shock group;△P＜0.05 vs shock+drainage group．圖1 各組大鼠肝組織H 2S含量的變化

2 各組大鼠肝組織CSE含量的變化

休克組大鼠肝組織CSE含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);休克+引流組、休克+引流+PPG組和休克+引流+NaHS組大鼠肝組織CSE含量均顯著低于休克組(P＜0.01)，3組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，見圖 2。

Figure 2．Changes of cystathionine γ-lyase(CSE)in rat liver tissues．Mean±SD．n=6．*P ＜ 0.05 vs sham group;##P ＜0.01 vs shock group．圖2 各組大鼠肝組織CSE含量的變化

3 各組大鼠肝功能生化指標的變化

休克組大鼠血漿AST、ALT和TBA水平顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，休克 +引流組大鼠血漿AST、ALT和TBA水平顯著低于休克組(P＜0.05)，加入PPG的休克+引流+PPG組血漿AST、ALT和TBA水平顯著低于休克+引流組(P＜0.05或P＜0.01)，而加入NaHS的休克+引流+NaHS組血漿AST和 ALT水平顯著高于休克 +引流組(P＜ 0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝功能生化指標的變化Table 1．Changes of biochemical indexes of hepatic functions in rats(Mean±SD．n=6)

4 各組大鼠肝組織形態(tài)學變化

假手術(shù)組大鼠肝索呈放射狀排列，血竇寬度基本正常，肝細胞核圓、核仁明顯、核膜清晰，可見雙核，胞漿染色嗜酸、均質(zhì)，見圖3A、B;休克組大鼠肝細胞排列稍紊亂，部分水腫，可見肝細胞壞死，見圖3C、D;休克+引流組肝細胞排列稍紊亂，核大小一致、圓形、居中，核膜清晰，見圖3E、F;休克+引流+PPG組肝索排列及肝細胞形態(tài)基本正常，肝小葉周邊細胞可見輕度水腫，見圖3G、H;休克 +引流+NaHS組肝細胞損傷程度明顯重于休克+引流組，見圖 3I、J。

Figure 3．Changes of hepatic pathomorphology in rats(HE staining;A，C，E，G，I，×100;B，D，F(xiàn)，H，J，×400)．A，B:sham group;C，D:shock group;E，F(xiàn):shock+drainage group;G，H:shock+drainage+PPG group;I，J:shock+drainage+NaHS group．圖3 各組大鼠肝組織形態(tài)學變化

5 各組大鼠肝組織炎癥因子的變化

如表2所示，休克組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05或P＜0.01)，休克 +引流組大鼠肝組織 TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α較休克組均出現(xiàn)了下降趨勢，IL-10、IL-12和 TNF-α含量顯著低于休克組(P＜0.05)，TNF-α含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);休克+引流+PPG組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量進一步下降，均顯著低于休克組(P＜0.05或P＜0.01)，TNF-α含量顯著低于休克 +引流(P＜0.05);而加入NaHS的休克+引流+NaHS組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，IL-10、IL-12和 TNF-α含量顯著高于休克+引流組(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 各組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量的變化Table 2．Changes of TLR4，IL-10，IL-12 and TNF-α in hepatic homogenate in rats［ng/(g protein)．Mean ±SD．n=6］

討 論

為了探討H2S在腸淋巴液引流減輕休克大鼠肝損傷中的作用，本研究首先檢測了各組大鼠肝組織中H2S的含量，發(fā)現(xiàn)休克組大鼠肝組織H2S含量顯著升高，腸淋巴液引流則降低了H2S含量，PPG進一步加強了腸淋巴液引流的作用，而腸淋巴液引流的作用被NaHS廢除。這些結(jié)果表明，腸淋巴液引流可降低肝組織H2S含量。一般來說，H2S由CSE以L-半胱氨酸為底物合成，由于CSE存在于血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞以及多個器官的組織細胞，故H2S可產(chǎn)生于機體的各個組織，發(fā)揮相應(yīng)的生物學效應(yīng)。因此，肝組織降低的H2S，既有來自于腸道產(chǎn)生的H2S隨著腸淋巴液引流至體外而減少的原因，又有腸淋巴液引流降低了毒性物質(zhì)引起血液循環(huán)系統(tǒng)以及肝臟本身產(chǎn)生H2S作用的因素。進一步研究發(fā)現(xiàn)，休克組大鼠肝組織CSE含量顯著升高，腸淋巴液引流與PPG降低了休克組大鼠肝組織的CSE含量，而NaHS對肝組織CSE含量無顯著影響，這說明腸淋巴液引流降低H2S的作用是通過抑制CSE活性實現(xiàn)的，而NaHS作為CSE的下游產(chǎn)物，在體內(nèi)可直接生成H2S，故外源NaHS對CSE活性無影響。

為了進一步探討抑制CSE活性、增加H2S含量是否影響了腸淋巴液引流減輕肝損傷的作用，本文觀察了反映肝功能的生化指標以及組織形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)休克組大鼠AST、ALT和TBA顯著升高，而腸淋巴液引流則抑制了這些指標的升高，從而減輕了肝損傷的程度;加入PPG使腸淋巴液引流的作用朝著更為有利的方向發(fā)展，相反加入NaHS的大鼠這些指標的變化與休克組相似，說明NaHS逆轉(zhuǎn)了腸淋巴液引流的作用。同樣的變化在肝組織形態(tài)學方面得到了證實。這些結(jié)果提示H2S具有降低腸淋巴液引流減輕失血性休克大鼠肝組織結(jié)構(gòu)損傷的作用，在腸淋巴液引流減輕肝損傷的過程中發(fā)揮負面作用。

研究表明，內(nèi)源性氣體分子H2S促進了失血性休克動物模型全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生，PPG可降低血漿TNF-α、IL-1、IL-6和 IL-10的含量，降低肺組織髓過氧化物酶活性［11，17］，提示H2S參與了失血性休克后器官損傷的發(fā)生。同樣的研究表明，H2S在嚴重燒傷小鼠炎癥反應(yīng)啟動的過程中具有重要意義［18］，TLR4在失控的炎癥反應(yīng)發(fā)生過程具有重要意義［19-20］，所以，本文從TLR4及其下游炎癥因子的變化，探討H2S在腸淋巴液引流減輕器官損傷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，休克組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量均顯著升高，腸淋巴液引流則降低了IL-10、IL-12和TNF-α的含量，表明腸淋巴液引流減輕了肝組織的炎癥反應(yīng);休克+引流組大鼠給予PPG后，進一步降低了肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α的含量;H2S供體NaHS在增加休克+引流組大鼠肝組織TLR4含量的同時，增加了肝組織IL-10、IL-12和TNF-α含量，提示外源性H2S加劇了這些組織器官的炎癥反應(yīng)，成為組織器官損傷的重要發(fā)病機制。值得注意的是，在創(chuàng)傷、失血等因素導致的炎癥反應(yīng)過程中，表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)的增高以及隨后的抗炎反應(yīng)增強，以至于表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)在高水平上的交替，這也成為失控的炎癥反應(yīng)、器官損傷的重要因素。在本研究中，失血性休克后抗炎細胞因子IL-10與炎癥介質(zhì)IL-12、TNF-α均出現(xiàn)了增高，提示此時機體處于炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)互相競爭的階段;而腸淋巴液引流均降低了肝組織炎癥介質(zhì)與抗炎因子的水平，這對于降低機體炎癥反應(yīng)是有利的;而PPG與NaHS對腸淋巴液引流后的作用也顯示，作為前炎癥氣體信號分子的H2S在腸淋巴液引流降低肝組織炎癥反應(yīng)的過程中發(fā)揮負面作用。

應(yīng)當指出，盡管休克腸淋巴液引流使肝組織TLR4含量有下降的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義，這可能與觀察時間等因素有關(guān);但給予CSE抑制劑PPG降低了肝組織的炎癥反應(yīng)，給予NaHS在增加TLR4的同時，亦導致了肝組織的炎癥反應(yīng)，結(jié)果說明H2S加重肝損傷的作用機制與炎癥反應(yīng)加劇有關(guān)。當然，這有待在以后的研究中進一步深入探討。同時，由于Mok等［11］的研究已經(jīng)證明了PPG可降低失血性休克大鼠血清的炎癥介質(zhì)水平，減輕肝的組織損傷，故本研究沒有設(shè)置PPG對休克大鼠作用的休克+PPG組。

總之，休克腸淋巴液引流可減輕失血性休克大鼠肝臟的組織學損傷與功能障礙，其作用機制與降低H2S含量有關(guān)。以腸淋巴液和氣體信號分子H2S作為干預(yù)靶點，對于防治失血性休克后的肝損傷具有重要意義。