盧雪梅， 黃演婷， 汪 潔， 金小寶， 朱家勇△

(1廣東藥學(xué)院藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006;2南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院，廣東廣州510515)

穿膜肽是一類能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)甚至細(xì)胞核而不損壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的小分子多肽，它的長(zhǎng)度一般不超過(guò)30個(gè)氨基酸。近幾年的研究證實(shí)，穿膜肽能運(yùn)載一系列具有不同生物學(xué)活性的物質(zhì)進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)，包括蛋白、多肽、核酸和寡聚核苷酸等［1］，為分子靶向診斷和治療提供了新的思路。肝細(xì)胞靶向穿膜肽(hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide，HTPP)來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其不但可特異性結(jié)合肝細(xì)胞表面的受體從而靶向肝臟［2］，同時(shí)還能夠有效穿透肝細(xì)胞膜，快速進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)部［3-4］，有望成為新型雙功能小分子穿膜肽。我們課題組以HTPP為靶向穿膜部位，家蠅天蠶素(Musca domestica cecropin，MDC)作為抗病毒作用部位，將二者在分子水平進(jìn)行了融合，構(gòu)建了新型肝靶向穿膜融合多肽 HTPP-MDC［5-6］。HTPP-MDC有望成為高效結(jié)合、定位準(zhǔn)確和靶向殺傷的新型生物導(dǎo)彈藥物，對(duì)降低乙型肝炎病毒感染引起的肝臟疾病的發(fā)病率和死亡率具有深遠(yuǎn)意義。

我們?cè)谇捌谘芯恐欣没蛑亟M技術(shù)將HTPP與MDC進(jìn)行了融合［5］，并通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了 HTPP-MDC［6］，本文主要在研究 HTPPMDC對(duì)乙型肝炎體外模型HepG2．2．15細(xì)胞株和人正常肝細(xì)胞Chang liver細(xì)胞株毒性作用的基礎(chǔ)上，探討HTPP-MDC對(duì)HepG2．2．15細(xì)胞乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎病毒 e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)分泌和乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA，HBV DNA)復(fù)制的影響及其在肝細(xì)胞中的定位，初步驗(yàn)證 HTPP-MDC抗 HBV作用，為 HTPPMDC的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1．1 主要儀器 熒光定量PCR儀和酶標(biāo)儀，Bio-Rad產(chǎn)品;二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Forma產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡，Leica產(chǎn)品;激光共聚焦顯微鏡，Olympus產(chǎn)品。

1．2 細(xì)胞株與主要試劑 HepG2．2．15細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone;G418購(gòu)自Beyotime;四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自Sigma;HBsAg ELISA試劑盒和HBeAg ELISA試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物技術(shù)有限公司;HBV DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司;蛋白異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記試劑盒購(gòu)自上海生工;HTPP-MDC為本實(shí)驗(yàn)室原核表達(dá)產(chǎn)物。其它化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2．1 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代 細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清，pH 7．2)，于200 mg/L G418培養(yǎng)基定期篩選。培養(yǎng)條件為95% ～98% 相對(duì)濕度、5%CO2、37℃。2～3 d換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)到70% ～80%時(shí)消化(含EDTA的 0．25%胰蛋白酶)傳代。實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞密度調(diào)整為1×109/L，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)活力大于85%。

2．2 HTPP-MDC對(duì)細(xì)胞株的毒性作用檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乙型肝炎體外模型HepG2．2．15細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞株Chang liver細(xì)胞各按1×108/L接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200μL，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，棄上清后加入200μL含不同濃度HTPP-MDC培養(yǎng)基(終濃度為 3．125、6．25、12．5、25、50 μmol/L)，同時(shí)設(shè)不加藥物的對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔。每24 h換相應(yīng)濃度新鮮培養(yǎng)基，72 h后每孔加100μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入100μL DMSO溶液，振蕩溶解后，570 nm處比色測(cè)定。按下式計(jì)算藥物作用下的細(xì)胞存活率:

細(xì)胞存活率(%)=藥物處理孔A值 ÷對(duì)照孔A值×100%。

2．3 HTPP-MDC干預(yù)實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)期 HepG2．2．15細(xì)胞按每孔1×105個(gè)接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后換含藥新鮮培養(yǎng)基(2% 胎牛血清)，其中 HTPP-MDC 終濃度分別為1．25、2．5、5 μmol/L，以4 mg/L拉米夫定(lamivudine，LMV)為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水為陰性對(duì)照，不含藥物孔為空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為時(shí)間依從性，加藥后每3 d收集上清液1次，再加入新的含藥培養(yǎng)基，共孵育9 d。收集的第3天、第6天和第9天上清液于－20℃保存，用于HBsAg、HBeAg與 HBV DNA檢測(cè)。

2．4 HBsAg和HBeAg檢測(cè) 采用ELISA試劑盒按試劑說(shuō)明書檢測(cè)HBsAg和HBeAg，按下式計(jì)算HTPP-MDC對(duì)HepG2．2．15細(xì)胞分泌 HBsAg和 HBeAg的抑制率:

抑制率(%)=(空白對(duì)照孔 A值－實(shí)驗(yàn)孔A值)/空白對(duì)照孔A值×100%。

2．5 HBV DNA測(cè)定 HBV DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品由達(dá)安基因公司直接提供，按HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書提取樣品DNA，取樣本2μL為模板，并同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照，各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增:93℃預(yù)變性2 min;93℃ 45 s，55℃ 1 min，10個(gè)循環(huán);93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。然后計(jì)算樣本HBV DNA拷貝數(shù)。

2．6 激光共聚焦技術(shù)研究HTPP-MDC在細(xì)胞中的定位 采用蛋白FITC標(biāo)記試劑盒標(biāo)記重組蛋白，具體操作為:將重組蛋白凍干粉用PBS溶解并與FITC(激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm)混合，室溫避光作用5 h，過(guò)凝膠柱純化，去掉未結(jié)合的FITC。制備HepG2．2．15細(xì)胞爬片，加入FITC標(biāo)記的HTPP-MDC，室溫作用10 min，用PBS洗滌4次，封片后用激光共聚焦顯微鏡觀察HTPP-MDC的細(xì)胞定位情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HTPP-MDC對(duì)細(xì)胞的毒性作用

不同濃度HTPP-MDC處理HepG2．2．15細(xì)胞和Chang liver細(xì)胞的存活率見(jiàn)表1。HTPP-MDC在3.125～50μmol/L濃度范圍內(nèi)，對(duì)正常肝細(xì)胞活力無(wú)影響。HTPP-MDC的濃度≤6.25μmol/L時(shí)，HepG2．2．15細(xì)胞存活率＞95%，為藥物作用濃度的安全范圍。

表1 HTPP-MDC 對(duì) HepG2．2．15和Chang liver細(xì)胞活力的影響Table 1．Effects of HTPP-MDCon the viability of HepG2．2．15 cells and Chang liver cells(Mean±SD．n=4)

2 HTPP-MDC 對(duì) HepG2．2．15細(xì)胞分泌 HBsAg和HBeAg的影響

HTPP-MDC 對(duì) HepG2．2．15細(xì)胞分泌 HBsAg和HBeAg抑制作用見(jiàn)圖1、2。當(dāng)HTPP-MDC作用3 d后，不同濃度的 HTPP-MDC對(duì) HepG2．2．15分泌HBsAg和HBeAg均具有顯著抑制作用(P＜0．01)。在相同濃度下，HTPP-MDC隨其作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率亦增加;同一時(shí)點(diǎn)，隨著HTPP-MDC濃度的增加，抑制率隨之增加。HTPP-MDC的作用表現(xiàn)出顯著的量效與時(shí)效關(guān)系。

Figure 1．Inhibitory effect of HTPP-MDC on HBsAg secretion in HepG2.2.15 cells．LMV:lamivudine;HTPP-MDC:hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide -Musca domestica cecropin．Mean ± SD．n=4．＊＊P ＜0.01 vs control group．圖1 HTPP-MDC對(duì)Hep G2．2．15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用

Figure 2．Inhibitory effect of HTPP-MDC on HBeAg secretion in HepG2.2.15 cells．LMV:lamivudine;HTPP-MDC:hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide-Musca domestica cecropin．Mean ± SD．n=4．＊＊P ＜0.01 vs control group．圖2 HTPP-MDC對(duì)HepG2．2．15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用

3 HTPP-MDC 對(duì) Hep G2．2．15 細(xì)胞 HBV DNA 復(fù)制的影響

HTPP-MDC對(duì) HepG2．2．15細(xì)胞 HBV DNA 復(fù)制的抑制作用見(jiàn)圖3。熒光定量PCR檢測(cè)各濃度HTPP-MDC 對(duì) HepG2．2．15 細(xì)胞作用 3、6 和 9 d后上清液中HBV DNA的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示當(dāng)HTPPMDC作用3 d后，HTPP-MDC對(duì)HepG2.2．15細(xì)胞分泌到上清中的HBV DNA均有顯著抑制作用(P＜0.01)，并且抑制程度依賴于藥物的處理濃度。

4 激光共聚焦技術(shù)研究HTPP-MDC在細(xì)胞中的定位

將重組 HTPP-MDC進(jìn)行 FITC標(biāo)記，與HepG2．2．15細(xì)胞孵育10 min后，激光共聚焦顯微鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)充滿綠色熒光，提示HTPP-MDC已經(jīng)透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入HepG2．2．15細(xì)胞內(nèi)部，見(jiàn)圖4。

討 論

HepG2．2．15細(xì)胞是將完整雙拷貝的乙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞株 HepG2細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選得到的肝胚瘤細(xì)胞系［7］。該細(xì)胞能穩(wěn)定分泌HBsAg、HBeAg及 Dane顆粒，并可在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到cccDNA，是目前體外研究乙肝病毒的復(fù)制規(guī)律和篩選抗乙肝病毒藥物的理想細(xì)胞模型［8］。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng) HepG2．2．15細(xì)胞為研究對(duì)象，研究HTPP-MDC體外抗 HBV活性。結(jié)果證實(shí)HTPP-MDC在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)HepG2．2．15細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，并且顯著抑制 HepG2．2．15細(xì)胞 HBsAg、HBeAg的分泌和HBV DNA復(fù)制，具有明顯的量效與時(shí)效關(guān)系。這說(shuō)明我們課題組設(shè)計(jì)的HTPP-MDC具有明確的體外抗HBV活性。

Figure 3．Inhibitory effect of HTPP-MDC on HBV DNA replication in HepG2．2．15 cells．LMV:lamivudine;HTPPMDC:hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide-Musca domestica cecropin．Mean±SD．n=4．＊＊P ＜0.01 vs control group．圖3 HTPP-MDC對(duì) HepG2．2．15細(xì)胞 HBV DNA 復(fù)制的抑制作用

Figure 4．Evaluation of cell penetrating activity of HTPP-MDCin HepG2．2．15 cells by confocal microscope detection．圖4 激光共聚焦觀察HTPP-MDC在細(xì)胞中的定位

近年抗菌肽的抗病毒研究逐漸成為熱點(diǎn)，抗菌肽的抗病毒機(jī)制涉及抑制病毒DNA復(fù)制，阻斷病毒黏附侵入，以及刺激機(jī)體免疫反應(yīng)等［9-11］。天蠶素類抗菌肽是其中研究歷史最長(zhǎng)，也是研究最多的一類抗菌肽，具有殺菌、抗病毒、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等多種功能。MDC是本實(shí)驗(yàn)室從家蠅中克隆的一種昆蟲(chóng)抗菌肽(GenBank登錄號(hào)為EF175878)，我們課題組前期研究顯示其不僅對(duì)多種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株［12］和臨床耐藥菌［13］均具有顯著的抗菌活性，還能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能，但對(duì)人正常肝細(xì)胞和紅細(xì)胞無(wú)毒［14］。更有意義的是 MDC對(duì)HepG2．2．15細(xì)胞的HBsAg表達(dá)具有抑制作用，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系。這些研究提示MDC對(duì)肝臟疾病的臨床治療具有良好的應(yīng)用前景。因此本課題組提出將MDC與HTPP進(jìn)行融合的設(shè)想。本研究證實(shí)設(shè)計(jì)的HTPP-MDC具有明確的體外抗HBV活性，同時(shí)激光共聚焦觀察也證實(shí)HTPP-MDC能夠有效穿透肝細(xì)胞膜，快速進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)部，表明之前的設(shè)計(jì)是成功的。目前抗菌肽抗病毒機(jī)制研究相關(guān)報(bào)道不多，根據(jù)有限的文獻(xiàn)［9-11］我們對(duì)HTPP-MDC抑制HBV復(fù)制的機(jī)制進(jìn)行大膽推測(cè)，認(rèn)為其可能涉及直接破壞病毒包膜、與病毒糖蛋白相互作用及免疫調(diào)節(jié)作用等，當(dāng)然具體的抗病毒機(jī)制還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

穿膜肽作為藥物運(yùn)輸工具，目前研究所發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)缺乏細(xì)胞特異性且定位不精確，限制了它的進(jìn)一步發(fā)展［15］。近年研究發(fā)現(xiàn)的 HTPP，來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白，在其序列中不僅含有1個(gè)PELEX/VTS(Plasmodium export element/vacuolar transport signal)基序，能夠有效穿透肝細(xì)胞膜，介導(dǎo)環(huán)子孢子蛋白進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞亞定位［3-4］，同時(shí)還具有肝素結(jié)合域，能夠特異性靶向肝臟［2］，因此HTPP將成為備受青睞的肝細(xì)胞靶向穿膜肽。

HTPP-MDC作為小分子多肽類藥物，具有作用明確、毒性低、同時(shí)兼有靶向肝細(xì)胞內(nèi)抗HBV和免疫調(diào)節(jié)多重作用，在開(kāi)發(fā)新型抗HBV藥物中具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值及市場(chǎng)應(yīng)用前景，但HTPP-MDC的體內(nèi)外抗病毒作用及其作用機(jī)制還需進(jìn)行深入研究。