施孟如， 南 超， 徐麗艷， 韓文文， 徐子琴， 李 冬， 邱俏檬， 盧中秋△

(1溫州醫(yī)科大學生物學實驗教學中心，浙江溫州325035;2溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診醫(yī)學中心，3溫州市人民醫(yī)院，浙江溫州325000)

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合癥，可引起膿毒性休克及多器官功能障礙綜合征，其中急性肺損傷是最常見的并發(fā)癥［1］。研究表明，Toll樣受體4-核因子 κB(Toll-like receptor 4-nuclear factorκB，TLR4-NF-κB)通路活化介導的過度炎癥反應在膿毒癥肺損傷中起重要作用［2-3］。瞬時受體電位陽離子通道V亞族成員1(transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 1，TRPV1)廣泛分布于感覺神經(jīng)纖維末梢上(C和Aδ)，感受傷害性刺激和疼痛。近年發(fā)現(xiàn)，TRPV1與TLR4及CD14共定位于感覺神經(jīng)末梢［4］，在膿毒癥中可被激活，并調(diào)節(jié)炎癥反應的程度［5-6］。TRPV1活化是否參與調(diào)節(jié)膿毒癥肺損傷的炎癥反應過程尚不明確。本研究以腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制造ICR小鼠內(nèi)毒素血癥模型，用辣椒素(capsaicin，CAP)和抗辣椒堿(capsazepine，CAPZ)分別激活和拮抗TRPV1，觀察小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路及下游腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)和IL-10的變化，以及P物質(zhì)(substance P，SP)和降血鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)水平隨TRPV1激活的變化情況，探討TRPV1活化對內(nèi)毒素血癥肺損傷炎癥反應的影響及機制。

材料和方法

1 試劑

LPS、CAP 和 CAPZ 購自 Sigma;IL-6、TNF-α、IL-10、CGRP和SP的ELISA試劑盒購自R＆D Systems，上海西唐生物科技有限公司進口分裝;抗小鼠NF-κB p65Ⅰ抗購自 Abcam;抗小鼠 TLR4Ⅰ抗購自Santa Cruz;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購自Milipore;辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、RIPA裂解液(強)、彩色預染蛋白分子量標準、顯影劑和定影劑購自碧云天生物技術(shù)研究所;ECL發(fā)光液購自Advansta。

2 方法

2．1 動物分組及干預 SPF級ICR小鼠108只，雄性，體重(20±2)g，由溫州醫(yī)學院動物中心提供。將小鼠隨機分為6組:正常對照組(n=18)、CAP對照組(n=18)、CAPZ對照組(n=18)、內(nèi)毒素血癥組(n=18)、CAP干預組(n=18)和CAPZ干預組(n=18)。正常對照組:給小鼠腹腔注射生理鹽水，3 h、8 h和16 h后麻醉活殺;CAP和CAPZ對照組:實驗開始前30 min預先給小鼠皮下注射CAP(1 mg/kg)或CAPZ(15 mg/kg)，腹腔注射生理鹽水后分別于3 h、8 h和16 h麻醉后活殺;內(nèi)毒素血癥組:給小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg后3 h、8 h和16 h麻醉后活殺;CAP和CAPZ干預組:實驗開始前30 min預先分別給小鼠皮下注射CAP(1 mg/kg)或CAPZ(15 mg/kg)，腹腔注射LPS10 mg/kg后3 h、8 h和16 h麻醉后活殺。以上各組活殺后取肺組織，－70℃保存。

2．2 ELISA法檢測肺組織細胞因子、SP及CGRP表達 取10%肺組織勻漿，用BCA法測定蛋白濃度，采用 ELISA 法檢測肺組織 SP、CGRP、IL-6、TNF-α 和IL-10水平，嚴格按照試劑盒說明書操作，檢測各因子濃度值，將濃度值除以相應各樣本蛋白濃度值，得出各因子相對水平。

2．3 Western blotting檢測肺組織TLR4和核內(nèi)NF-κB表達 按照核蛋白提取試劑盒說明書提取肺組織核蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取40μg蛋白上樣量，先進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉(zhuǎn)膜、封閉，Ⅰ抗、Ⅱ抗孵育，ECL顯影，曝光。Quantity One分析軟件進行灰度分析，用同一目的蛋白與內(nèi)參照灰度比值表示此目的蛋白的相對含量。

2．4 肺組織病理學改變 小鼠活殺后取肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，觀察肺組織病理學改變。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19．0軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多樣本間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，若方差不齊則進行秩和檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 內(nèi)毒素血癥組小鼠行為學改變及CAP和CAPZ的影響

正常對照組、CAP對照組和CAPZ對照組小鼠反應靈敏，呼吸平穩(wěn)，黏膜紅潤，皮毛光滑，行動自如。內(nèi)毒素血癥模型組則在2 h左右出現(xiàn)精神萎靡，呼吸急促，倦怠懶動，反應變慢，進食減少，四肢水腫，其中下肢水腫稍重;8 h上述癥狀加重，反應遲鈍，可見眼部有較多分泌物，體溫降低，四肢發(fā)抖;16 h精神更加萎靡，刺激后無反應，眼部因分泌物較多而無法睜開，口唇發(fā)紺，體溫較低，四肢冰冷。CAP干預組小鼠癥狀較內(nèi)毒素血癥組明顯減輕，而CAPZ干預組小鼠癥狀稍有加重。

2 CAP和CAPZ對內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織TNF-α、IL-6和IL-10水平的影響

由圖1可見，與同時點正常組比較，內(nèi)毒素血癥模型組TNF-α、IL-6和IL-10在各時點明顯升高(P＜0．05)，且分別在8 h、16 h 和16 h 達峰值，CAP 對照組和CAPZ對照組與之比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05);與同時點內(nèi)毒素血癥模型組比較，CAP干預組TNF-α和IL-6在3 h、8h和16 h 3個時點明顯降低(P ＜0．05)，而其 IL-10 則在3 h、8 h和16 h 3 個時點明顯升高(P＜0．05)，CAPZ干預組則反之(P＜0．05)。

3 CAP和CAPZ對內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織SP和CGRP水平的影響

由表1、2可見，與正常組比較，內(nèi)毒素血癥組各時點SP和CGRP明顯升高(P＜0．05)，且均于8 h達峰值，CAP對照組和CAPZ對照組各時點SP和CGRP也有明顯變化(P＜0．05)，但升幅不及同時點內(nèi)毒素血癥組及CAP干預組明顯;與同時點內(nèi)毒素血癥組比較，CAP干預組各時點SP和CGRP升高明顯(P ＜0．05)，CAPZ干預組則降低明顯(P ＜0．05)。

4 內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織TLR4和NF-κB水平的變化及CAP和CAPZ的作用

與同時點正常對照組相比，內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織TLR4水平明顯升高(P＜0．05)，且在8 h達峰值，CAP對照組和CAPZ對照組TLR4表達水平變化無統(tǒng)計學意義(P＞0．05);與同時點內(nèi)毒素血癥組相比，CAP干預組和CAPZ干預組TLR4表達水平變化不明顯(P ＞0．05)，見圖2、表3。

與同時點正常對照組相比，內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織核內(nèi)NF-κB水平明顯升高(P＜0．05)，且在8 h達峰值，CAP對照組、CAPZ對照組NF-κB無明顯變化(P＞0．05);與內(nèi)毒素血癥組比較，CAP干預組小鼠肺組織核內(nèi)NF-κB水平明顯降低(P＜0．05)，而CAPZ干預組則明顯升高(P＜0．05)，見圖3、表4。

5 小鼠肺組織病理學改變

光鏡下可見，正常對照組、CAP對照組和CAPZ對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡腔內(nèi)無炎癥細胞浸潤，肺間質(zhì)無滲出;內(nèi)毒素血癥組8 h和16 h可見肺泡大小不等，部分肺泡壁斷裂呈氣腫狀，部分肺泡萎陷，肺泡壁增寬，肺泡毛細血管擴張，肺間質(zhì)見多形核炎癥細胞浸潤;與內(nèi)毒素血癥組相比，CAP干預組肺泡壁毛細血管擴張、炎癥細胞浸潤及間質(zhì)水腫程度明顯減輕;CAPZ干預組無明顯加重，見圖4。

Figure 1．Changes of cytokines in the lung tissue of mice at 3 h(A)，8 h(B)and 16 h(C)．Mean ± SD．n=6．*P ＜0．05 vs normal control group;#P ＜0．05 vs endotoxemia group．圖1 不同時點小鼠肺組織細胞因子的變化

表1 不同時點小鼠肺組織SP水平變化Table 1．Changes of substance Pin the lung tissue of mice at different time points［ng/(g protein)．Mean ±SD．n=6］

表2 各時點小鼠肺組織CGRP水平變化Table 2．Changes of CGRPin the lung tissue of mice at different time points［ng/(g protein)．Mean ± SD．n=6］

Figure 2．Changes of TLR4 protein in the lung tissue of mice at different time points．圖2 不同時點各組小鼠肺組織TLR4水平變化

表3 不同時點各組小鼠肺組織TLR4相對表達量的變化Table 3．Changes of TLR4 protein relative quantity in the lung tissue of mice at different time points(Mean±SD．n=6)

Figure 3．Changes of NF-κB protein in the lung tissue of mice at different time points．圖3 不同時點各組小鼠肺組織NF-κB表達變化

表4 不同時點各組小鼠肺組織NF-κB相對表達量的變化Table 4．Changes of NF-κB protein relative quantity in the lung tissue of mice at different time points(Mean±SD．n=6)

Figure 4．Pathological changes of the lung tissue of mice in different groups(HE staining，×200)．A:normal control;B:CAP control;C:CAPZ control;D:endotoxemia;E:CAPtreatment;F:CAPZ treatment．圖4 各組小鼠肺組織病理學改變

討 論

TRPV1是一種非選擇性陽離子通道，可被辣椒素激活，也可被脂質(zhì)、質(zhì)子、陽離子、有害熱等激活［7］，主要定位于分泌SP和CGRP的感覺神經(jīng)纖維(C和Aδ)，CAP是其激動劑，而CAPZ是其拮抗劑。TRPV1作為傷害性刺激感受器，激活時炎癥或骨癌中的疼痛反應會加重。目前，有人用不同劑量CAP干預大鼠膿毒癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小劑量CAP可降低膿毒癥大鼠 TNF-α和 IL-6，升高 IL-10，而大劑量CAP則可使大鼠膿毒癥加重［6］，本文采用了小劑量CAP干預內(nèi)毒素血癥小鼠，并在其基礎(chǔ)上進一步檢測了NF-κB和TLR4水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRPV1激活后明顯降低內(nèi)毒素血癥小鼠TNF-α和IL-6水平，升高IL-10，而TRPV1拮抗后效果與之相反，這在正反兩方面說明TRPV1激活后可減輕內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織炎癥反應程度，減少肺損傷。CAP對照組以及CAPZ對照組炎癥因子水平較正常對照組無顯著變化，這說明TRPV1在正常狀態(tài)下不能影響以上炎癥因子的表達。但與此同時，TRPV1激活后可調(diào)節(jié)NF-κB水平卻不能調(diào)節(jié)TLR4水平，這說明TRPV1在內(nèi)毒素血癥中的調(diào)節(jié)作用不是通過TLR4實現(xiàn)的。而先前Diogenes等［8］也發(fā)現(xiàn)，用LPS刺激三叉神經(jīng)可激活TRPV1受體，但用TLR4拮抗劑阻斷TLR4后，TRPV1無法被激活，由此可以推測，TLR4可能位于TRPV1調(diào)節(jié)位點上游。

眾所周知，TRPV1激活后可導致SP和CGRP水平升高，故肺組織SP和CGRP水平可以作為TRPV1激活與否的指示劑。另外，CAP對照組的SP以及CGRP水平顯著升高，而其NF-κB水平變化卻不明顯，其原因可能有以下3個:(1)在沒有LPS刺激情況下，NF-κB激活基礎(chǔ)量較低，可能 SP以及 CGRP的升高對其激活量變化有影響，但是幅度較低，在WB圖像上表現(xiàn)不明顯。(2)也可能SP和CGRP的對NF-κB的調(diào)控作用比較復雜，在沒有LPS刺激情況下，CAP激活所導致的SP以及CGRP水平較低，SP以及CGRP在水平較低情況下對NF-κB作用平衡關(guān)系較大劑量的情況不一樣，所呈現(xiàn)出來的綜合結(jié)果就是NF-κB表達沒有受到明顯影響，這需要通過實驗明確。(3)CAP干預組NF-κB水平變化較明顯，而CAP對照組NF-κB水平變化不明顯，可能是因為CAP對NF-κB的作用必須在有LPS刺激的情況下才能發(fā)揮，這點需要通過細胞實驗進一步證實。

關(guān)于TRPV1激活影響NF-κB活化的機制尚不明確。本研究表明，膿毒癥小鼠TRPV1激活后血清SP和CGRP水平升高，而后兩者可能是參與調(diào)節(jié)NF-κB活化及炎癥反應水平的重要物質(zhì)。Ang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，SP的升高能激活ERK1/2并誘導NF-κB活化，促進炎癥反應。盡管這一作用機制不能解釋我們研究結(jié)果，但揭示了SP可能是TRPV1激活后影響NF-κB活化的可能機制。另有研究顯示，CGRP可降低膿毒癥小鼠血清TNF-α水平、提高IL-10和IL-6水平［10］，且可抑制朗格漢斯細胞中NF-κB的激活［11］，可見CGRP也參與了 TRPV1激活影響 NF-κB活化的過程。然而，盡管TRPV1的激活后可促進血清SP水平的升高，但同時TRPV1激活可導致生長抑素的釋放［12］，而后者卻可抑制 SP 的釋放［13］，由此可見，TRPV1激活后SP水平受到雙向調(diào)控。所以，TRPV1激活后可能SP及CGRP影響NF-κB活化及炎癥反應，但是TRPV1激活對SP及CGRP的調(diào)控非常復雜，有待進一步研究闡明。

綜上所述，內(nèi)毒素血癥小鼠TRPV1激活可能通過SP及CGRP影響NF-κB水平并降低肺組織炎癥因子水平，減輕肺部炎癥損傷，這為膿毒癥肺損傷治療提供了新思路和靶標。