鐘東佳， 黃永亨， 龍?zhí)熘?俞建東， 林澤宇， 閔 軍， 萬云樂

(1中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510120;2廣東藥學院附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510080;3廣州市婦女兒童醫(yī)療中心乳腺外科，廣東廣州510180;4中山大學附屬第六醫(yī)院肝膽胰外科，廣東廣州510655)

研究表明，白細胞介素15(interleukin 15，IL-15)和IL-2擁有非常相似的生物學效應(yīng)，但其來源細胞和靶細胞分布卻遠較IL-2廣泛［1-2］。在不表達IL-2的部位，IL-15也可以發(fā)揮類似IL-2的生物學效應(yīng)。梁廷波等［3］報道，與 IL-2和干擾素 γ(interferonγ，IFN-γ)不同，IL-15參與了大鼠肝臟和心臟移植更加早期的急性排斥反應(yīng)事件，認為其可能是獲得移植物急性排斥反應(yīng)早期診斷的一個重要指標。但IL-15分子表達的調(diào)節(jié)機制至今仍不甚明確。研究發(fā)現(xiàn)，在IL-15基因調(diào)控序列中存在一些保守性序列，其中研究比較清楚的是NF-κB結(jié)合位點，其位于IL-15基因上游序列－75到－65區(qū)域，反式作用因子人T淋巴細胞白血病病毒Tax蛋白與其結(jié)合能夠高效誘導IL-15 mRNA的表達，LPS與其作用也能促進IL-15 的表達［4］。

我們的課題組早期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)門靜脈回輸供肝自然殺傷(natural killer，NK)細胞能明顯減輕［60Co］照射處理的大鼠移植肝急性排斥反應(yīng)程度［5］，說明供肝來源的NK細胞在肝臟移植免疫中發(fā)揮了一定的作用，但其確切機制尚未明確。本實驗擬在已有的研究基礎(chǔ)上，進一步觀察大鼠移植肝組織內(nèi)和外周血IL-15的表達水平，及脾組織內(nèi)NF-κB的表達活性變化，探討供肝NK細胞減輕移植后急性排斥反應(yīng)的作用機制。

材料和方法

1 材料

1．1 動物 雄性BN(RT1n)大鼠和Lewis(RT11)大鼠，重量200～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。供、受體大鼠術(shù)前8 h禁食，術(shù)后不禁飲食，自由飲水。

1．2 主要試劑 MR6804(PE-conjugated anti-rat NKR-P1，mouse IgG1)、MR5301(FITC-conjugated anti-rat CD3，mouse IgM)、MR5101(FITC-conjugated anti-rat CD4，mouse IgG1)和MR5201(FITC-conjugated anti-rat CD8，mouse IgG1)均購自Caltag;IL-15抗體(H-114)購自Santa Cruz;IL-15 ELISA試劑盒為武漢華美科技生物公司產(chǎn)品;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒為碧云天生物科技研究所;核蛋白抽提試劑盒、非放射性凝膠電泳遷移實驗(eletrophoretic mobility shift assay，EMSA)試劑盒［Ds-Bio-NFKB probe:Bio-5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'-Bio，工作液濃度為500 fmol/μL(用量 0．6 μL，300 fmol);Ds-Cold-NFKB probe:5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’，工作液濃度15 pmol/μL(用量2．0 μL，30 pmol，100× 競爭)］、陽性對照(50 μg/L TNF 刺激SGC7901細胞45 min后提取核蛋白的EMSA實驗結(jié)果，NF-κB 陽性對照核蛋白濃度1．8 μg/μL，用量3．6μg)和EMSA-Plus試劑盒(陽性核抽提物對照和陰性核抽提物對照)均為Viagene產(chǎn)品。

1．3 主要儀器 酶標儀，南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司;WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)、DYCZ-24DN型電泳儀和DYCZ-40D型電泳儀(轉(zhuǎn)膜)均為北京六一儀器廠產(chǎn)品;CoolImager圖像分析系統(tǒng)，Viagene產(chǎn)品。

2 方法

2．1 大鼠原位肝移植模型的建立和實驗分組 改良“二袖套”法建立大鼠肝移植模型，Lewis大鼠作為肝移植供體，BN大鼠為受體，實驗動物根據(jù)處理情況隨機分為3組［5］。A組:急性排斥組 (Lewis-BN)，移植供、受體大鼠均不作任何處理;B組:供體單純［60Co］照射排斥組(Lewis-BN+供體［60Co］照射)，移植術(shù)前 Lewis大鼠全身［60Co］(100 mGy/min，10 Gy)照射，照射3 d后作為肝移植供體;C組:［60Co］照射+供肝NK門靜脈回輸排斥組(Lewis-BN+供體［60Co］照射+受體門靜脈輸注供肝NK細胞)，移植術(shù)前Lewis大鼠全身［60Co］照射，待移植肝血管、膽管重建完成后，于門靜脈套管遠端緩慢輸注Lewis大鼠肝臟NK細胞懸液(1×109cells/L)。各大組又分移植后第1、3、7天3個亞組(n=6)，并分別于術(shù)后第1、3、7天處死受鼠，抽取外周血和切取移植肝、受鼠脾組織，用于實驗指標的檢測。各組自然存活大鼠10只(自然存活亞組)。光學顯微鏡下觀察移植肝組織病理切片，按Banff標準(主要依據(jù)匯管區(qū)炎癥嚴重程度、膽管炎癥損傷程度、靜脈內(nèi)皮炎癥嚴重程度)對急性排斥反應(yīng)進行病理學分級，以排斥活動性指數(shù)(rejection activity index，RAI)進行評分，RAI 0～2分定為無排斥，3分為交界性改變，4～5分為輕度排斥，6～7分為中度排斥，8～9分為重度排斥。在移植肝組織中，如果發(fā)生炎癥性和(或)壞死性動脈炎，提示為重度急性排斥反應(yīng)［5］。

2．2 供肝NK細胞分離與純化 參考龍?zhí)熘龋?］的方法分離、純化Lewis大鼠肝臟NK細胞。簡要步驟如下:1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)下腔靜脈全身肝素化，經(jīng)腹主動脈慢速灌注生理鹽水10 mL至肝臟顏色變白后取下肝臟。PBS 50 mL經(jīng)門靜脈快速灌注，經(jīng)下腔靜脈收集灌注液。結(jié)扎肝上、肝下下腔靜脈，用肝細胞消化液37℃下經(jīng)門靜脈保留灌注10 min，剪碎肝組織，繼續(xù)消化，過目后收集細胞懸液，低速離心去肝細胞，得到的懸濁液用完全RPMI-1640培養(yǎng)液重懸。經(jīng)大鼠單個核淋巴細胞分離液分離所得細胞懸液，收集大鼠肝臟單個核淋巴細胞。根據(jù)大鼠NK細胞表面的特異性標志物(CD3－及 NKR-P1+)，使用Dynabeads FlowCompTMFlexi系統(tǒng)，先通過 DSB-X-conjugated anti-CD3進行陰性分選，再通過DSB-X-conjugated anti-NKR-P1進行陽性分選，進一步純化肝臟 NK細胞，流式細胞術(shù)檢測CD3－、NKR-P1+細胞群的純度大于90%。臺盼藍拒染率判斷所得細胞活性，細胞拒染率＞95%。

2．3 ELISA法檢測外周血IL-15表達水平 于移植術(shù)后第1、3、7天處死受鼠，抽取外周血2 mL，自然凝固后離心，分離血清，等量分裝于500μL的Eppendorf管內(nèi)，－70℃保存，整批待檢。按IL-15 ELISA試劑盒操作說明書檢測移植后大鼠血漿IL-15的表達水平，所有檢測均設(shè)置復孔。根據(jù)標準IL-15濃度曲線，計算出檢測樣品中IL-15的含量(ng/L)。

2．4 Western blotting法檢測移植肝組織IL-15的表達 于移植術(shù)后第1、3、7天處死受鼠，切取移植肝。取移植肝組織100 mg，加入1 mL RIPA和10μL 100 mol/L PMSF和10μL磷酸酶抑制劑，勻漿，高速離心取上清液，轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，用考馬斯亮藍法對上清液進行蛋白定量，－20℃保存;取等蛋白量的各樣品SDS-PAGE電泳后，將分離膠蛋白帶轉(zhuǎn)印到醋酸纖維素膜上，沖洗、封閉后與鼠抗IL-15(1∶200)(含2%脫脂奶粉)4℃孵育過夜。沖洗后再與羊抗鼠Ⅱ抗(含2%脫脂奶粉)室溫中孵育2 h。洗膜，吸干，加入ECL化學發(fā)光試劑(試劑盒)，暗房置入膠片曝光，顯影、定影后，自然晾干膠片，WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro32來分析膠片中的蛋白條帶中的灰度值。同法檢測上清液樣品中β-actin蛋白灰度值，以IL-15/β-actin灰度比值表示樣品中IL-15的表達值。

2．5 NF-κB活性檢測 于移植術(shù)后第1、3、7天處死受鼠，切取移植鼠脾臟。按核蛋白抽提試劑盒說明書提取核蛋白，蛋白定量后－70℃保存?zhèn)溆?按非放射性EMSA試劑盒說明書檢測大鼠脾組織中NF-κB活性。步驟如下:結(jié)合體系10×結(jié)合液2μL，poly(dI:dC)1μL，核蛋白1～3μL，生物素標記的探針0．5 μL，補水至10 μL，室溫放置20 min，加入10×上樣緩沖液;制備6．5%聚丙烯酰胺凝膠;預電泳120 V、1 h;上樣后180 V電泳70 min;轉(zhuǎn)膜，穩(wěn)流390 mA，40 min;紫外交聯(lián) 5 min;封閉 30 min;1∶750 streptavidin-HRP反應(yīng)20 min;1×Wash Buffer洗膜4×5 min;平衡 5 min;化學發(fā)光檢測，最后采用CoolImager圖像分析各條帶吸光度(A)。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用軟件SPSS 13．0統(tǒng)計分析;組間比較作單因素方差分析(One-way ANOVA)及LSD-t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組受鼠移植術(shù)后肝組織病理學觀察和自然存活觀察

移植肝組織急性排斥反應(yīng)Banff評分結(jié)果顯示，移植術(shù)后第1天A、B和C組3組均無急性排斥反應(yīng)(RAI為1～2分);術(shù)后第3天，都出現(xiàn)輕中度排斥反應(yīng)(RAI為3～6);移植術(shù)后第7天，各組表現(xiàn)為中到重度的排斥反應(yīng)(RAI為7～9)。3組大鼠自然存活時間分析顯示，A組的平均生存時間為(45．00±3．40)d，B 組平均存活時間(13.75±1.53)d，C 組平均生存時間(26.00±5.09)d，組間比較差異有統(tǒng)計學意義，說明供肝NK細胞經(jīng)門靜脈輸注有助于延長肝移植受鼠的自然生存時間，見圖1。

Figure 1．The postoperative pathological changes in each group(HE staining，×40)．At 3 d after operation，lymphocytes infiltrated in the portal area．At 7 d after operation，obvious inflammatory cell infiltration scattered in coagulative necrosis foci．圖1 各組術(shù)后的病理學改變

2 術(shù)后各組受鼠外周血清IL-15的表達水平

術(shù)后第1天，3組血漿IL-15均無明顯變化，組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。術(shù)后第3、7天，3組IL-15水平較第1天顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。術(shù)后第3、7天，B組IL-15水平較其余2組高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，見表1。

表1 各組受鼠術(shù)后第1、3、7天外周血IL-15表達水平變化Table 1．Expression levels of IL-15 in peripheral blood of the rats at 1，3 and 7 d after transplantation(ng/L．Mean±SD．n=6)

3 各組移植肝組織IL-15蛋白表達水平

術(shù)后第3天，B組肝組織中IL-15水平較A、C兩組高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，術(shù)后第7天，B組肝組織中IL-15水平較A、C兩組高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，見圖2和表2。

4 各組受鼠脾組織中NF-κB活性

術(shù)后第3天，B組NF-κB活性較A、C兩組高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，A、C兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05);術(shù)后第7天，B組NF-κB活性較A、C兩組高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，見圖3和表3。

Figure 2．Expression of IL-15 in transplanted liver tissues at 1，3 and 7 d after transplantation．圖2 術(shù)后第1、3、7天移植肝組織IL-15蛋白的表達

表2 各組受鼠術(shù)后第1、3、7天移植肝組織IL-15的表達Table 2．Expression of IL-15 in liver tissues of the rats at 1，3 and 7 d after transplantation(Mean±SD．n=6)

Figure 3．NF-κB activity in spleen tissues after transplantation．A:1 d of group A;B:1 d of group B;C:1 d of group C;D～F:3 d of the three groups;G～I:7 d of the three groups;J～K:normal BN rats;L:100-fold nonlabeled probe;M:positive control;N:negative control．圖3 術(shù)后第1、3、7天脾組織NF-κB活性

表3 各組受鼠術(shù)后第1、3、7天脾組織NF-κB活性Table 3．Activity of NF-κB in spleen tissue of the rats at 1，3 and 7 d after transplantation(Mean±SD．n=6)

5 受鼠脾細胞NF-κB活性與移植肝組織內(nèi)IL-15表達的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)分析，NF-κB活性與IL-15表達水平之間呈顯著正相關(guān)(r=0．977，P ＜0．01)。

討 論

本課題前期研究結(jié)果顯示，移植術(shù)后第3、7天，B組的RAI值明顯高于A組的RAI值，提示供鼠用［60Co］照射處理后可加劇移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng);C組比B組的RAI值低，提示供肝NK細胞經(jīng)門靜脈輸注可減輕移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)。B組平均生存時間較A組明顯縮短(P＜0．01);C組平均生存時間較B組明顯延長(P＜0．01)，提示供肝NK細胞經(jīng)門靜脈輸注有助于延長受鼠的生存時間。

本研究結(jié)果顯示術(shù)后第3、7天，3組受鼠外周血IL-15水平均較第1天時顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，術(shù)后第3天 IL-15表達水平達到高峰，說明IL-15參與了肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的早期事件，與文獻報道相符［3，7］。Conti等［7］研究發(fā)現(xiàn)，存在排斥反應(yīng)的肝移植患者的血及肝組織中IL-15的表達均增高。Baan等［8］用免疫組化實驗證實，巨噬細胞來源的IL-15參與了急性排斥反應(yīng)，它通過誘導T淋巴細胞發(fā)揮細胞毒作用，從而導致移植物功能喪失。梁廷波等［3］對移植心及移植肝組織內(nèi)不同時點的IL-15、IL-2及其受體進行檢測，發(fā)現(xiàn)IL-15及其受體在表達時間上早于IL-2，表達部位也與之不同，IL-15主要表達在血管內(nèi)皮細胞、單核細胞及移植物的實質(zhì)細胞上，而IL-2表達在移植物內(nèi)浸潤的淋巴細胞上，說明IL-15主要來源于非淋巴細胞。這些結(jié)果說明，IL-15有可能是一個重要的移植器官急性排斥反應(yīng)的早期監(jiān)測指標。

本研究中，移植術(shù)后第3、7天，經(jīng)門靜脈輸注供肝NK細胞的B組受鼠外周血IL-15的表達水平情況和肝組織中IL-15的表達規(guī)律相似，且均明顯高于其它2組，差異有統(tǒng)計學意義。上述結(jié)果提示，供肝內(nèi)固有的NK細胞在肝移植免疫中可能通過下調(diào)受鼠IL-15的表達，調(diào)節(jié)移植宿主對移植物的免疫攻擊。

然而，IL-15表達的調(diào)節(jié)機制至今仍不甚明確。本研究中，采用了EMSA法檢測受鼠脾組織中NF-κB的活性，結(jié)果提示經(jīng)門靜脈輸注供肝NK細胞可以下調(diào)受鼠脾組織中NF-κB的活性。研究發(fā)現(xiàn)，在IL-15基因調(diào)控序列中存在一些保守性序列，包括人干擾素調(diào)節(jié)因子1(interferon regulatory factors 1，IRF-1)、IRF-2、IRF-3，白細胞介素 6 核因子(nuclear factor of IL-6，NF-IL-6)，Myb轉(zhuǎn)錄因子(鳥類成髓細胞瘤病毒癌基因v-myb同系物，v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)和NF-κB等結(jié)合位點，其中研究比較清楚的是NF-κB結(jié)合位點。NF-κB由5個亞單位組成，其中p50和p52屬于 NF-κB家族，而 CRel、RelA(p65)及 RelB屬于 Rel家族，靜息狀態(tài)下NF-κB二聚體與其抑制性亞單位IκB結(jié)合形成p65-p50-IκB三聚體復合物，當細胞受到致炎因子等活化因素刺激時，IκB磷酸化降解，暴露信號區(qū)，p65-p50從胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)與靶基因的NF-κB位點結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄［9］。NF-κB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，能與調(diào)控免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞生長分化和凋亡等所需的許多細胞因子、黏附分子等基因的啟動子或增強子的κB位點特異性結(jié)合，啟動和調(diào)節(jié)這些基因的轉(zhuǎn)錄，在機體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞生長分化和凋亡等方面起重要作用［10］。Ennaciri等［11］的研究表明，呼吸道合胞病毒感染單核細胞THP1后活化蛋白激酶C，進而上調(diào)IL-15 mRNA的水平，進一步的實驗發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，活化的NF-κB(主要是NF-κB家族的p65)結(jié)合IL-15啟動子序列NF-κB結(jié)合位點可增強IL-15的轉(zhuǎn)錄。Mullarky等［12］則發(fā)現(xiàn)，IFN-γ 在促進IL-15 mRNA表達的過程中與LPS、NF-κB等其它因素有協(xié)同作用。由此說明，供肝NK細胞極有可能通過下調(diào)NF-κB的表達活性從而直接調(diào)控IL-15的表達，進而減輕肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)。