賴義明， 黃 海， 凌逸虹， 曾樂祥， 陳杰青， 曹 億，余永晟， 張思敏， 張一鳴， 李 金， 王淦平， 郭正輝△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1泌尿外科，3小兒外科，5急診外科，廣東廣州510120;2中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科，廣州510060;4深圳市第二人民醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳518035;6增城市人民醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州511300)

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年增加［1］。前列腺癌早期無明顯癥狀，大部分患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，錯(cuò)失最佳的治療時(shí)機(jī)，因此，尋找具有高度靈敏性和特異性的前列腺癌腫瘤標(biāo)記物很有必要。婆羅雙樹基因(Spalt，SAL)最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，在果蠅的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［2］。婆羅雙樹樣基因 4(Sal-like 4，SALL4)是SAL的4個(gè)人類同源異型基因之一，其編碼的蛋白包含多個(gè)C2H2雙鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger，ZF)，是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)SALL4蛋白在胚胎干細(xì)胞的干性維持、自我更新及快速增殖過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［3］，SALL4表達(dá)對(duì)于生殖細(xì)胞腫瘤、急性髓性白血病、骨髓增生異常綜合征、乳腺癌及肺癌等腫瘤的診斷具有重要的臨床意義［4-8］。目前，國內(nèi)外尚未有關(guān)于SALL4在前列腺癌中的相關(guān)研究，其在正常前列腺以及前列腺癌組織中的表達(dá)情況尚不清楚。本研究通過前列腺癌細(xì)胞系、良性增生前列腺和前列腺癌組織切片，應(yīng)用間接免疫熒光、RT-PCR、Western blotting和免疫組化的方法，探討SALL4蛋白在前列腺癌中的表達(dá)情況，并闡明其和臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

1．1 主要試劑 RNAiso Plus總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒購自TaKaRa。SALL4兔抗人多克隆抗體購自Abcam。免疫組織化學(xué)的工作濃度為1∶50，采用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的免疫組化試劑。Dylight 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。其它試劑購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1．2 前列腺癌細(xì)胞系及組織標(biāo)本 (1)人前列腺癌LNCaP、DU145和PC-3細(xì)胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞系由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林百欣醫(yī)學(xué)研究中心獲得。(2)前列腺石蠟標(biāo)本為2007～2012年中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院泌尿外科手術(shù)標(biāo)本。其中前列腺癌組織68例，前列腺增生組織30例，正常前列腺組織采用內(nèi)對(duì)照共68例，年齡(66．5±8．1)歲，所有標(biāo)本均為初發(fā)，術(shù)前未做任何治療，術(shù)后均由甲醛固定，石蠟包埋保存。標(biāo)本均由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院病理科提供。

2 方法

2．1 免疫熒光染色法 將處于對(duì)數(shù)生長期的LNCaP、DU145、PC-3和RWPE-1細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用PBS洗3次;用4%多聚甲醛和0．1%Triton X-100固定通透各30 min，PBS洗3次;用1% 牛血清白蛋白室溫封閉1 h;加入SALL4兔抗人多克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜后用PBS洗3次，同時(shí)用正常兔血清代替Ⅰ抗作為對(duì)照同法進(jìn)行反應(yīng)，用來驗(yàn)證兔抗人SALL4抗體的特異性;加入1∶100稀釋的 Dylight 488-山羊抗兔IgG，于室溫?fù)u床孵育1 h，PBS洗3次;DAPI(1∶1 000)復(fù)染核1 min，PBS 洗3 次，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2．2 RT-PCR檢測(cè)前列腺癌LNCaP、DU145和PC-3細(xì)胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞系中SALL4 mRNA的表達(dá) 取 LNCaP、DU145、PC-3和RWPE-1細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入RNAiso Plus 1 mL，待細(xì)胞徹底勻漿后轉(zhuǎn)移至1．5 mL EP管，按RNAiso Plus說明書提取細(xì)胞總RNA。提取后溶于去離子水中，測(cè)量RNA含量。取上述各樣本總RNA各1μg，按25μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為:37℃ 15 min，85℃5 s，4℃ 1 s。PCR 引物由 Invitrogen合成，SALL4引物序列為:正義鏈 5’-CCCGGCAGTAAGGACTGTC-3’，反義鏈 5’-TCTCTGTCTTTAGGTACACCACA-3’。PCR產(chǎn)物為97 bp，PCR反應(yīng)體系:98℃ 10 s，55℃30 s，72℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物的半定量分析:瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。應(yīng)用凝膠圖像掃描系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行吸光度掃描，計(jì)算出SALL4與GAPDH的吸光度(A)比值，結(jié)果以SALL4/GAPDH表示。

2．3 Western blotting法檢測(cè)前列腺癌 LNCaP、DU145和PC-3細(xì)胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞系中SALL4蛋白的表達(dá) 向細(xì)胞加入含有PMSF的 RIPA裂解液，冰上裂解 30 min。4℃、12 000 r/min離心30 min，將上清移至新的EP管。然后對(duì)所得的蛋白液進(jìn)行BCA法測(cè)濃度。配制8%分離膠和5%濃縮膠，按每孔50μg的上樣量恒壓電泳。然后將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜后，用5%脫脂奶粉封閉。將目的條帶孵育在 GAPDH(1∶1 000，碧云天)和SALL4(1∶800，Abcam)Ⅰ抗稀釋液中4℃過夜。第2天再孵育Ⅱ抗1 h，然后用超敏ECL發(fā)光液(Millipore)及黑白膠片(柯達(dá))進(jìn)行曝光。

2．4 免疫組化染色檢測(cè)前列腺組織中SALL4蛋白的表達(dá) 前列腺癌和增生前列腺組織4 mm厚石蠟切片，二甲苯脫蠟10 min×2，梯度乙醇水化。將切片浸入3%過氧化氫，避光作用10 min，PBS洗片3次，將切片放入檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液(碧云天)塑料盒中，微波爐抗原修復(fù)21 min(高火7 min，中火14 min)，冷卻至室溫。PBS洗片2次，擦凈周圍水分，滴加第Ⅰ抗體，濕盒內(nèi)4℃ 孵育過夜，PBS洗片2次。擦凈周圍水分，滴加Ⅱ抗，濕盒內(nèi)室溫30 min，PBS洗片2次。擦凈周圍水分，滴加DAB顯色劑(中杉金橋)，3～5 min后顯微鏡觀察染色的效果，自來水終止反應(yīng)。擦凈周圍水分，滴加蘇木素(1∶20，中杉金橋)染核5 min，自來水終止反應(yīng)。光學(xué)顯微鏡下讀片，記錄染色強(qiáng)度，封固。SALL4陽性染色標(biāo)準(zhǔn):染色均勻，呈棕色顆粒樣。對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量判定:染色強(qiáng)度依次為0分(無色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色);染色范圍以染色細(xì)胞所占的百分比評(píng)分:陽性細(xì)胞＜25%為0分，25% ～50%為1分，51% ～75%為2分，＞75%為3分。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比的乘積為免疫組化的結(jié)果:0分判斷為(－)，1分和2分判斷為(+)，3分和4分判斷為(++)，6分和 9分判斷為(+++)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LNCaP、DU145、PC-3 和 RWPE-1 細(xì)胞中SALL4的定位分析

用兔抗人SALL4抗體作為Ⅰ抗建立間接細(xì)胞免疫熒光法，對(duì) LNCaP、DU145、PC-3和 RWPE-1細(xì)胞中SALL4蛋白的表達(dá)分布進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，RWPE-1細(xì)胞中SALL4含量較低，熒光顯微鏡下只見微弱熒光;LNCaP、DU145和PC-3細(xì)胞內(nèi)SALL4表達(dá)量較RWPE-1細(xì)胞顯著增強(qiáng)，且主要分布在細(xì)胞漿內(nèi)，胞核和胞膜也有少量表達(dá)，見圖1。用PBS代替Ⅰ抗作為對(duì)照，按同法與上述4種細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，熒光顯微鏡下均未見細(xì)胞出現(xiàn)熒光。

2 RT-PCR檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系及正常前列腺細(xì)胞SALL4 mRNA的表達(dá)

由圖2可見，目標(biāo)基因及內(nèi)參照條帶清晰，比例正確。A260/A280分別為 1．895、1．955、1．926 和1.885，RNA質(zhì)量滿意。被擴(kuò)增的2條DNA片段分別為 SALL4和GAPDH。SALL4 mRNA在RWPE-1、LNCaP、DU145和PC-3細(xì)胞中均有表達(dá)，表達(dá)水平無明顯差異(P ＞0．05)。

3 Western blotting檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系及正常前列腺細(xì)胞SALL4蛋白的表達(dá)

從圖3中可以看出3種前列腺癌細(xì)胞中SALL4蛋白的表達(dá)量要明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

4 免疫組化染色檢測(cè)前列腺癌、前列腺增生及正常前列腺組織中SALL4蛋白的表達(dá)

染色結(jié)果顯示，陽性染色僅見于前列腺癌上皮細(xì)胞及部分增生前列腺上皮細(xì)胞和少量正常前列腺上皮細(xì)胞，前列腺癌基底細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞均未見陽性染色，見圖4。SALL4在前列腺癌組織中的蛋白表達(dá)水平明顯高于增生前列腺和正常前列腺(P＜0．01)，而在正常前列腺和增生前列腺間的表達(dá)水平無顯著差異，見表1。SALL4表達(dá)水平與Gleason評(píng)分、前列腺癌臨床分期、預(yù)后及組織前列腺特異抗原(prostatespecific antigen，PSA)表達(dá)密切相關(guān);而與患者年齡、治療前血清總PSA水平、前列腺體積及組織雄激素受體(androgen receptor，AR)表達(dá)無明顯相關(guān)性，見表2。

Figure 1．Intracellular distribution of SALL4 in LNCaP，DU145，PC-3 and RWPE-1 cells detected by immunofluorescence(×400)．圖1 免疫熒光染色法檢測(cè)LNCaP、DU145、PC-3和RWPE-1細(xì)胞中SALL4的表達(dá)分布

Figure 2．Expression of SALL4 mRNA in prostate cancer cell lines LNCaP，DU145 and PC-3，and normal prostate epithelial cell line RWPE-1．M:marker;1:RWPE-1;2:LNCaP;3:DU145;4:PC-3;5:RWPE-1;6:LNCaP;7:DU145;8:PC-3．圖2 前列腺癌LNCaP、DU145和PC-3細(xì)胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞系SALL4 mRNA的表達(dá)

Figure 3．The expression of SALL4 proteins in prostate cancer cell lines LNCaP，DU145 and PC-3，and normal prostate epithelial cell line RWPE-1 was evaluated by Western blotting．Mean ± SD．n=3．*P ＜ 0．05 vs LNCaP，DU145 and PC-3 cells．圖3 前列腺癌LNCaP、DU145和PC-3細(xì)胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞系SALL4蛋白的表達(dá)

Figure 4．Expression of SALL4 protein in prostate tissues(immunohistochemistry，× 400)．A:cancerous prostate tissues，SALL4 was located in the cytoplasm and part of it in the nucleus;B:hyperplastic prostate tissues，both cytoplasm and nucleus were negative;C:normal prostate tissues，both cytoplasm and nucleus were negative;D:negative control．圖4 SALL4蛋白在前列腺組織中表達(dá)

表1 前列腺癌、增生前列腺和正常前列腺組織SALL4染色結(jié)果Table 1．Positive staining of SALL4 in cancerous，hyperplastic and normal prostate tissues

表2 68例前列腺癌病理組織的臨床病理資料與SALL4蛋白表達(dá)的相關(guān)分析Table 2．Correlation of the SALL4 expression with the clinicopathologic features of 68 prostate cancer cases

討 論

前列腺癌的生物學(xué)行為和病理組織形態(tài)均較為復(fù)雜，單純地依靠任何一種常規(guī)的病理學(xué)觀察或臨床檢查結(jié)果來判斷前列腺癌患者病情的惡性程度和預(yù)后常存在一定的困難和偏差，常引起漏診、誤診。PSA作為前列腺癌標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的篩查，但是很多良性前列腺疾病以及包括直腸指診、前列腺穿刺活檢等在內(nèi)的多種常規(guī)檢查方法均可導(dǎo)致血清PSA水平的升高，這嚴(yán)重影響了PSA單獨(dú)用于診斷前列腺癌的準(zhǔn)確性。懷疑前列腺癌，治療前血清PSA在4．0～10．0μg/L范圍內(nèi)，行穿刺活檢的患者約有高達(dá)75%被證實(shí)為非癌［9］。尋求新的高靈敏性和特異性的前列腺癌腫瘤標(biāo)記物顯得迫切而且非常重要。前列腺癌的基礎(chǔ)研究表明，多種基因及相關(guān)分子共同參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，其中SALL4基因是SALL家族成員之一，定位于人染色體20q13．13 ～ 13．2。SALL 基 因 家 族 包 括 SALL1 到SALL4 4個(gè)成員，最早克隆于與果蠅同源的DNA序列(Sal)［2］。Sal是果蠅生長發(fā)育必須的同源異構(gòu)基因［10］。人類SALL基因家族與人的正常生長發(fā)育密切相關(guān)［11］。

SALL4包含4個(gè)外顯子，由于外顯子2內(nèi)部拼接模式的不同，其可以編碼SALL4A和SALL4B 2種異構(gòu)體蛋白。SALL4A和SALL4B表達(dá)廣泛且具有組織特異性，可見于腦、肺、腎、睪丸、卵巢和CD34+細(xì)胞，但后者不表達(dá)于 CD34+細(xì)胞［5］。SALL4A 和SALL4B能夠形成同質(zhì)或異質(zhì)二聚體，并在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用［12］。SALL4A和SALL4B雖然有許多相似的結(jié)構(gòu)，但它們也有不完全相同的結(jié)合位點(diǎn)，它們可以與不同的干性因子相互作用，在小鼠胚胎干細(xì)胞中僅需SALL4B的存在就可以維持其多能狀態(tài)［13］。在人類中，SALL4的缺失或突變與多種疾病相關(guān)，包括Okihiro綜合征、acro-renal-ocular綜合征和IVIC綜合征，這些疾病均以多器官畸形為特征，如耳畸形、聽力喪失以及肢體、心臟和腎臟等臟器的缺陷等［14-16］。與許多胚胎干性因子不同，SALL4可以在成體干細(xì)胞尤其是造血前體細(xì)胞中表達(dá)，SALL4可以通過下游的Bmi-1調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的生長［17］。SALL4的過度表達(dá)能促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞的增殖和維持自我更新［18］。SALL4調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)和造血干/祖細(xì)胞自我更新的功能可能與表觀遺傳機(jī)制有關(guān)［19］。

本研究結(jié)果顯示SALL4蛋白在細(xì)胞中主要表達(dá)于胞漿，在胞核中也有微量表達(dá)，在3種前列腺癌細(xì)胞株中SALL4的蛋白表達(dá)水平均要明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1(P＜0．05)，而SALL4 mRNA的表達(dá)水平在4種細(xì)胞系中無明顯差異(P＞0．05)，說明SALL4可能主要在蛋白水平起作用。免疫組化結(jié)果顯示正常前列腺與前列腺增生組織中SALL4陽性表達(dá)分別為22．06%和23．33%，而在前列腺癌中有接近95．6%的標(biāo)本 SALL4陽性表達(dá)顯著增高(P＜0．01)，而且其陽性表達(dá)強(qiáng)度與 Gleason評(píng)分、臨床分期、預(yù)后及組織中PSA的表達(dá)密切相關(guān)。有類似的研究表明SALL4過表達(dá)于不同的惡性腫瘤，在結(jié)直腸癌中，大約90%的腫瘤標(biāo)本有SALL4過表達(dá)，并且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度密切相關(guān)［20］，在乳腺癌中也有86．1%的腫瘤SALL4表達(dá)增高，甚至在腫瘤的早期就可以增高［7］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)93%的肺癌有 SALL4 表達(dá)水平的增高［8］。Cao等［4］的研究表明在所有類型的睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中，SALL4是維持腫瘤低分化狀態(tài)所必須的。另外，SALL4也表達(dá)于超過90%的轉(zhuǎn)移性精原細(xì)胞瘤、未成熟型畸胎瘤、胚胎性癌，SALL4可作為睪丸、卵巢和性腺外轉(zhuǎn)移性生殖細(xì)胞腫瘤一種新的診斷標(biāo)志物［21］。目前有研究表明 SALL4 與 Wnt、PTEN、NFКB及凋亡等信號(hào)通路密切相關(guān)，如在結(jié)直腸癌中，SALL4過表達(dá)可以通過轉(zhuǎn)錄抑制促凋亡基因PTEN而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，并且通過表觀遺傳修飾Bmi-1使上皮細(xì)胞分化基因持續(xù)受到抑制，引起結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)喪失黏附性而促進(jìn)其轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)中［20］。在乳腺癌中，SALL4可抑制黏附基因CDH1并且上調(diào)CDH1抑制基因ZEB1，從而促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移［22］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)前列腺特異性膜抗原可能通過上調(diào)ERK蛋白的活性正向調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的生長、遷移，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同情況下ERK與SALL4的表達(dá)具有高度的一致性，磷酸化的ERK可能通過進(jìn)入胞內(nèi)激活SALL4啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞快速增殖機(jī)制［23-24］。這些研究提示在前列腺癌中SALL4表達(dá)的增高也可能通過上述信號(hào)通路起作用。

本研究在前列腺癌中闡明了SALL4在蛋白表達(dá)水平作為腫瘤標(biāo)志物的臨床重要性。結(jié)合我們的研究結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，我們認(rèn)為SALL4對(duì)于前列腺癌的研究具有重要意義，SALL4蛋白可能成為未來前列腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的重要標(biāo)記物。它在前列腺癌進(jìn)展中的作用可以通過它在前列腺癌中過度表達(dá)并且與Gleason評(píng)分、臨床分期、預(yù)后及組織中PSA這幾個(gè)代表著惡性程度的指標(biāo)密切相關(guān)被證明。SALL4蛋白可能將成為診斷前列腺癌新的腫瘤標(biāo)志物，并可能具有評(píng)估前列腺癌患者病情、指導(dǎo)臨床治療方案及判斷預(yù)后的作用。但在前列腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中，SALL4的具體生物學(xué)作用和調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。