馬泳泳, 黃 進, 周淑娟, 葛杭萍, 俞 康
(1溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科,浙江溫州325000;2中南大學湘雅醫(yī)院腫瘤科,湖南長沙410000)
多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種漿細胞惡性克隆增生性疾病,是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[1]。目前仍不可治愈。傳統(tǒng)化療和自體干細胞移植可使患者得到暫時緩解,但往往短期復發(fā)并產(chǎn)生耐藥。目前臨床涌現(xiàn)一些新藥[2],在治療中取得了顯著的抗骨髓瘤效應,但仍未改變MM不可治愈的現(xiàn)狀,需要從分子生物學水平進一步揭示其發(fā)病機制。
多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機制涉及染色體易位、細胞因子異常、骨髓微環(huán)境改變以及信號通路異常等[3-4]。膜受體酪氨酸蛋白激酶信號轉導途徑(Ras/Raf/MEK/MAPK通路)是其發(fā)病機制的重要信號通路[5]。
含IQ模序的GTP酶活化蛋白1(IQmotif-containing GTPase-activating protein 1,IQGAP1)是近年新發(fā)現(xiàn)的一個蛋白家族,其基因位于染色體15q26上,是基因擴增熱點,其所在位點基因變異和表達增加,已在多種腫瘤組織和不同腫瘤細胞株中被觀察到[6-8]。IQGAP1 蛋白結合 Ras/Raf/MEK/MAPK 通路上多個蛋白成分,最近有研究證實抑制胰腺癌及黑色素瘤患者IQGAP1蛋白表達可實現(xiàn)RAF/MEK/ERK 途徑的阻斷[9]。
IQGAP1在骨髓瘤細胞中是否表達增高?目前尚無此類報道。其機制是否類似其在胰腺癌及黑色素瘤患者的機制——通過與RAF/MEK/ERK途徑上ERK結合實現(xiàn)?本文就IQGAP1在人骨髓瘤細胞RPMI8226和U266細胞中的表達及其機制進行研究。
RPMI-1640培養(yǎng)液為 Gibco產(chǎn)品。胎牛血清(fetal calf serium,F(xiàn)CS)購自杭州四季青生物公司。TRIzol購自Invitrogen。逆轉錄試劑盒購自 Fermentas。白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)購自北京天象邦定公司。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)購自 PeproTech。細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、p-ERK1/2、蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)、p-Akt、信號轉導子及轉錄激活子3(signal transducers and activator of transcription 3,STAT3)、p-STAT3和 β-actin購自 Cell Signaling technology。OneStep RT-PCR試劑盒均為Qiagen產(chǎn)品。MTT購自Sigma。其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海吉凱基因技術有限公司根據(jù)設計合成,見表1。
表1 引物序列Table1.Sequencesfor primers
2.1 細胞株的培養(yǎng) 多發(fā)性骨髓瘤細胞株 RPMI8226和U266由溫州醫(yī)學院內科實驗室長期保存細胞株,實驗前從-196℃液氮罐中取出,快速復蘇后用含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸后,置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d換液1次。選擇對數(shù)生長期細胞進行實驗。
2.2 RT-PCR檢測RPMI8226和U266細胞IQGAP1 mRNA的表達 各收集骨髓瘤細胞U266和RPMI8226,細胞密度為4×109/L。使用shRNA表達質粒沉默 RPMI8226細胞 IQGAP1(clone 1、clone 2、clone 3和 clone 4),收集骨髓瘤細胞,同時設 RPMI8226-shRNA陰性對照組和RPMI8226未轉染組。
采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細胞的總RNA,分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照One Step RT-PCR試劑盒實驗操作說明進行RT-PCR,總反應體積50.0μL,其中5× One-Step RT-PCR buffer 10.0 μL,dNTP Mix 2.0 μL,OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μL,5 × Q-Solution 10.0 μL,RNase inhibitor 10 U,RNA 1.0 μg,引物0.6μmol/L。其退火溫度為54℃。然后,取 RTPCR產(chǎn)物10.0 μL,加上樣緩沖液 2.0 μL,在2%瓊脂糖凝膠上電泳,70 V 40 min,凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實驗結果,凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel-Pro Analyzer 3.0)分析目的基因與β-actin基因條帶吸光度比值。
2.3 Western blotting檢測IQGAP1蛋白及ERK1/2、Akt、STAT3總蛋白及磷酸化蛋白水平
收集正常淋巴細胞、RPMI8226和U266骨髓瘤細胞各4×109/L,PBS清洗后加入蛋白抽提裂解液50μL抽提細胞總蛋白,冰浴15 min,離心收集細胞總蛋白。蛋白提取物經(jīng)定量后,30μg上樣至8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠,電泳,常規(guī)轉膜,檢測IQGAP1表達。
使用shRNA表達質粒沉默RPMI8226細胞IQGAP1(clone 1、clone 2、clone 3 和clone 4),收集骨髓瘤細胞,抽提蛋白,同時設RPMI8226-shRNA陰性對照組和RPMI8226未轉染組,檢測IQGAP1表達過程同上步。
收集 RPMI8226-shIQGAP1組 (clone 1)、RPMI8226-shRNA陰性對照組和RPMI8226未轉染組細胞,抽提蛋白,電泳,轉膜后后者經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后,分別與1∶500稀釋度的相應Ⅰ抗(抗p-ERK1/2抗體、抗ERK1/2抗體、抗 Akt抗體、抗 p-Akt抗體、抗STAT3抗體和抗p-STAT3抗體)和適宜稀釋度的Ⅱ抗(羊抗鼠Ig-HRP)孵育,經(jīng)Odyssey顯色系統(tǒng)顯色,收集蛋白印跡圖。
2.4 沉默IQGAP1 特異性沉默人IQGAP1的shRNA質粒(KH0073P)購自Bioscience。寡核苷酸序列如下:5'-CAACGACATTGCCAGGGATAT-3'(clone 1);5'-AAACTGACCCTGTGGATATTT-3'(clone 2);5'-ACAGATTCCTGCAGCTAAACT-3'(clone 3);5'-GCATGCTGCAGCTAAACT-3' (clone 4);5'-GGAATCTCATTCGATGCATAC-3'(陰性對照)。RPMI8226細胞生長至80%密度時,轉染RPMI8226細胞,轉染后的細胞加入500 mg/L G418篩選,經(jīng)2周后形成陽性克隆,將克隆轉至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)并傳代建系,分別命名為 clone 1-、clone 2-、clone 3-、clone 4-RPMI8226-shIQGAP1和陰性對照細胞。
2.5 MTT增殖抑制實驗 以每孔2×108/L的細胞密度接種于96孔板中,200μL/well;分3組:VEGF組(VEGF濃度為20.0 ng/L)、IL-6組(IL-6濃度為20.0 ng/L)和無VEGF/IL-6組;各組再分為3個亞組:RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性對照組和RPMI8226未轉染組。經(jīng)12、24和48 h后每孔加入MTT(濃度為5 g/L)20μL,37℃放置4 h;離心,棄上清液,每孔加入DMSO 150μL,混勻吹打,使沉淀充分溶解;用酶聯(lián)免疫分析儀讀取490 nm處的吸光度(A),并用以下公式計算各組細胞增殖抑制率。實驗設4個平行孔,重復實驗3次。增殖抑制率(%)=(1-藥物組A值/對照組A值)×100%。
2.6 免疫共沉淀 將 RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性對照組和RPMI8226未轉染組3組細胞(每組約1×107個細胞)用RIPA裂解液冰上裂解30 min,12 000 r/min(r=8.5 cm)離心15 min收集蛋白上清;Bradford法對蛋白定量后,調蛋白濃度成一致;用相應Ⅰ抗免疫沉淀目標蛋白,4℃旋轉過夜;然后用25μL瓊脂糖珠子捕獲免疫沉淀復合物,4℃反應3 h;RIPA洗滌沉淀復合物3遍,3×SDSloading緩沖液重懸沉淀,煮沸后使蛋白變性;離心收集樣品上清,-80℃保存或進一步用Western blotting檢測。
用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
RT-PCR和Western blotting結果顯示,U266和RPMI8226骨髓瘤細胞中IQGAP1 mRNA和蛋白表達增高,與正常淋巴細胞比較有顯著差異,見圖1。
RT-PCR及Western blotting結果顯示,RPMI8226-shIQGAP1(clone 1~4)組的IQGAP1 mRNA和蛋白較RPMI8226-shRNA陰性對照組和RPMI8226未轉染組表達明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義,見圖2。
與RPMI8226-shRNA陰性對照組和RPMI8226未轉染組比較,RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組ERK1/2磷酸化水平下降70.2%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而3組Akt和STAT3蛋白的磷酸化水平無明顯差別,見圖3。
Figure 1.IQGAP1 was overexpressed in human myeloma cell lines.A:RT-PCR showed the mRNA expression of IQGAP1 in two human myeloma cell lines(U266 and RPMI8226)and the control(normal lymphocytes);B:Western blotting showed the protein expression of IQGAP1 in two human myeloma cell lines(U266 and RPMI8226)and the control(normal lymphocytes).Mean ± SD.n=3.*P <0.05 vs control.圖1 IQGAP1在人骨髓瘤細胞株中過表達
Figure 2.Effects of shRNA on the expression of IQGAP1 in human myeloma cell line RPMI8226.A:RT-PCR showed the mRNA expression of IQGAP1 in RPMI8226-shIQGAP1,RPMI8226-shRNA negative control and un-transfected RPMI8226 cells;B:Western blotting showed the protein expression of IQGAP1 in RPMI8226-shIQGAP1,RPMI8226-shRNA negative control and un-transfected RPMI8226 cells.Mean±SD.n=3.*P <0.05 vs RPMI8226-shRNA negative control and un-transfected RPMI8226.圖2 轉染shRNA后IQGAP1在人骨髓瘤細胞株RPMI8226中的表達
Figure 3.Effects of shRNA knockdown of IQGAP1 on phosphorylation of the proteins in different signal transduction pathways in human myeloma cell line RPMI8226.Mean ±SD.n=3.*P <0.05 vs other groups.圖3 RPMI8226-shIQGAP1、RPMI8226-shRNA陰性對照和未轉染RPMI8226細胞的各通路蛋白及其磷酸化蛋白的表達
沉默RPMI8226細胞IQGAP1 12、24和48 h后用 MTT檢測細胞增殖活性,RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組較RPMI8226-shRNA陰性轉染組和RPMI8226細胞未轉染組明顯下降,差異顯著(P<0.05)。VEGF共培養(yǎng)、IL-6共培養(yǎng)和無VEGF/IL-6共培養(yǎng)的3個亞組在12、24和48 h及RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性轉染組和RPMI8226細胞未轉染組間無明顯差異,見圖4。
免疫共沉淀使用抗IQGAP1抗體,Western blotting檢測使用抗ERK1/2抗體。在RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組無 ERK1/2蛋白表達,而 RPMI8226-shRNA陰性對照組和未轉染RPMI8226組均有IQGAP1和ERK1/2蛋白表達,見圖5。
Figure 4.Effects of shRNA knockdown of IQGAP1 on the proliferation of human myeloma cell line RPMI8226.A:12 h;B:24 h;C:48 h.Mean ± SD.n=3.*P <0.05 vs other groups.圖4 RPMI8226-shIQGAP1、RPMI8226-shRNA陰性對照和未轉染RPMI8226細胞的增殖活性
多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機制涉及染色體易位、細胞因子異常、骨髓微環(huán)境改變以及信號通路異常等。Ras-MAP通路是細胞因子、生長因子和激素等廣泛涉及的信號轉導通路,此通路的持續(xù)激活與人類多種腫瘤尤其是造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生有關。ras癌基因及其信號轉導通路在MM的發(fā)病中起著重要作用,有ras突變的MM患者其生存期更短且對化療不敏感。多種細胞因子和生長因子如IL-6[10-11]、胰島素樣生長因子I和VEGF等均能激活此通路,并通過整合素實現(xiàn)細胞間相互聯(lián)系,共同調控MM細胞的生長與耐藥性。
Figure 5.IQGAP1-ERK interaction in human myeloma cell line RPMI8226.圖5 在人骨髓瘤細胞RPMI8226中IQGAP1與ERK相互作用
IQGAPs是近年新發(fā)現(xiàn)的一個蛋白家族,其序列中含有類似于GTP酶催化域的廣泛序列和位于N端的4個可與鈣調蛋白相互作用的IQ模序,在哺乳動物中有3個同源物即IQGAP1~3。
IQGAP1是3個人類IQGAP同系物中發(fā)現(xiàn)最早的[12],不同于IQGAP2和IQGAP3限制性表達于肝和腸道等器官,其呈現(xiàn)出一種全身性地表達[13-14]。IQGAP1是Rho家族GTP酶成員Rac1和cdc42的一個重要效應因子,能與細胞骨架和黏附成分廣泛作用[15],通過調節(jié)MAPK途徑,可以影響細胞增殖和分化,在細胞黏附和遷移的信號網(wǎng)絡中發(fā)揮關鍵作用[16]。IQGAP1基因位于染色體15q26上,是基因擴增熱點,其所在位點基因變異和表達增加已在多種腫瘤組織和不同腫瘤細胞株中被觀察到[17],如乳腺癌、肺癌、子宮內膜癌等。
本研究用 RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn),U266及 RPMI82262骨髓瘤細胞 IQGAP1 mRNA表達增高,Western blotting檢測2種細胞中的IQGAP1蛋白表達增高,與正常淋巴細胞比較差異顯著;而用shRNA表達質粒沉默 RPMI8226細胞 IQGAP1后,RPMI8226-shIQGAP1(clone 1~4)組的IQGAP1蛋白較RPMI8226-shRNA陰性對照組和未轉染RPMI8226組表達明顯減少。同時使用MTT法檢測細胞增殖,發(fā)現(xiàn)RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組在12、24和48 h細胞增殖活性較RPMI8226-shRNA陰性對照組和RPMI8226未轉染組明顯下降,證實沉默骨髓瘤細胞中IQGAP1表達可影響細胞增殖。有趣的是,本研究發(fā)現(xiàn)在外源性VEGF、IL-6和無VEGF/IL-6作用下,RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性對照組和未轉染RPMI8226組在不同時間(12 h、24 h和48 h)活性無顯著差異,可能存在除VEGF及IL-6外的其它激活IQGAP1的因子。
本研究的第二部分是探討IQGAP1在骨髓瘤的發(fā)病中的作用機制,是否類似其在胰腺癌及黑色素瘤患者的機制——通過與結合RAF/MEK/ERK途徑中ERK實現(xiàn)。本文檢測RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性對照組和RPMI8226未轉染組p-ERK1/2、p-Akt和p-STAT3蛋白水平,發(fā)現(xiàn)在RPMI8226-shIQGAP1組ERK1/2磷酸化水平較其它2組下降70.2%,而3組Akt和STAT3蛋白的磷酸化水平無明顯差別。進一步的免疫共沉淀更證實,在RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組無ERK蛋白表達,而RPMI8226-shRNA陰性對照組和未轉染RPMI8226組均有IQGAP1和ERK蛋白表達,說明IQGAP1在骨髓瘤發(fā)病中的作用機制是通過結合RAF/MEK/ERK途徑中ERK實現(xiàn)的。
IQGAP1在骨髓瘤細胞中過表達,其機制可能通過與MAPK途徑的ERK相互作用實現(xiàn)。抑制IQGAP1可實現(xiàn)阻斷骨髓瘤內過度活躍的RAF/MEK/ERK信號通路。IQGAP1可能成為骨髓瘤治療的全新方法及靶點。