朱柄銘， 陳文璟， 蘇運(yùn)欽， 溫旺榮

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東廣州510632)

糖尿病腎病是糖尿病重要的微血管病變之一，終末期患者5年存活率僅為20%［1］，是I型糖尿病患者的主要死因;在II型糖尿病中其嚴(yán)重性僅次于心、腦血管疾?。?］。由于其呈漸進(jìn)式緩慢發(fā)展，起病隱匿，加之當(dāng)今診斷手段的局限性，不易早期診斷及治療，一旦確診，整個(gè)病程將無法逆轉(zhuǎn)。這就需要我們發(fā)現(xiàn)能早期對(duì)其進(jìn)行診斷的標(biāo)志物。研究證明microRNAs(miRNAs)在糖尿病及其并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用，但研究都局限于動(dòng)物模型或者組織細(xì)胞，也有對(duì)血漿研究的報(bào)道，而缺乏對(duì)血清中相關(guān)miRNAs表達(dá)的研究。miRNAs能游離于細(xì)胞，穩(wěn)定存在于血清中，且血清miRNAs檢測(cè)具有創(chuàng)傷小、靈敏度和特異性高的特點(diǎn)［3-4］，這就為糖尿病腎病的分子診斷，尤其對(duì)早期臨床癥狀、體征不明顯的患者提供了早期診斷與預(yù)測(cè)的可能。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

2012/04～2013/05暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的門診、住院病人以及健康體檢者125例，其中符合WHO糖尿病專家委員會(huì)提出的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)且尿微量白蛋白(urinary microalbumin，UmAlb)在正常參考范圍 (＜14.29 mg/L)的25例II型糖尿病患者為糖尿病A(diabetes mellitus A，DMA)組，平均年齡(58.28±9.02)歲，男13例，女12例;符合II型糖尿病診斷，且UmAlb超出正常參考范圍(＞14.29 mg/L)，同時(shí)其腎臟檢驗(yàn)學(xué)及影像學(xué)檢測(cè)指標(biāo)均無異常的25例患者為糖尿病B(diabetes mellitus B，DMB)組，平均年齡(59.64±10.19)歲，男15例，女10例;經(jīng)腎臟檢驗(yàn)學(xué)、影像學(xué)以及病理學(xué)活檢確診的25例糖尿病腎病患者為糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)組，平均年齡(60.28±8.89)歲，男16例，女9例;由糖尿病腎病引發(fā)且符合美國(guó)腎臟病基金會(huì)K/DOQI專家組對(duì)慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)分期建議中的CKD5期，且出現(xiàn)尿毒癥癥狀的25例患者為尿毒癥(uraemia，UM)組，平均年齡(61.84±9.56)歲，男12例，女13例;25例性別、年齡相匹配的健康體檢者設(shè)為正常對(duì)照(normal control，NC)組，平均年齡(57.00 ±9.36)歲，男14 例，女11例，其腎臟檢驗(yàn)學(xué)和影像學(xué)檢測(cè)指標(biāo)均未見異常且無任何糖尿病病史。

2 主要試劑及儀器

TRNzol-A+和RNase-Free ddH2O購自北京Tiangen;氯仿、異丙醇和無水乙醇購自廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄5×Buffer和dNTP購自Invitrogen;MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司;血清miRNA實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒HairpinitTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit、線蟲 miRNA CelmiR-39的雙鏈mimics及Hsa-miR-21和Cel-miR-39逆轉(zhuǎn)錄引物購自上海GenePharm;中國(guó)科技大學(xué)中佳公司KDC-160HR高速冷凍離心機(jī);ESCO生物安全柜 (II級(jí)B2型);Eppendorf公司生產(chǎn)的Biophotomet生物分光光度計(jì)及加樣槍;Applied Biosystems公司生產(chǎn)的ABI7000型定量PCR儀。

3 方法

3．1 血清制備 用真空無抗凝管抽取實(shí)驗(yàn)對(duì)象3～4 mL外周靜脈血，常溫下待血液凝固，1 h內(nèi)進(jìn)行處理。血標(biāo)本在3 500 r/min下離心10 min，轉(zhuǎn)移上層血清至1.5 mL Eppendorf管，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3．2 總RNA抽提 冷藏血清樣本置冰上融化后，充分混勻，吸取200μL加入3倍體積TRNzol-A+中，于振蕩器上充分混勻，勻漿在室溫靜置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。為控制提取過程中樣本間的差異，在靜置結(jié)束后，向每份勻漿樣本中加入人工合成的20μmol/L線蟲Cel-mirR-39 mimics 4μL作為外源性內(nèi)參照，充分混勻，用于提取、逆轉(zhuǎn)錄及后續(xù)定量檢測(cè)全過程。4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清。加入120 mL氯仿，劇烈漩渦混勻15 s，室溫靜置3 min。4℃、12 000 r/min離心12 min。將離心得到的水相(約400μL)轉(zhuǎn)移至新的 Eppendorf管中，再加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置25 min。4℃、12 000 r/min離心 10 min，去上清。用 RNase-Free ddH2O與無水乙醇配制的1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4℃、5 000 r/min離心3 min。吸凈上清，室溫晾干約2～3 min，加入30μL RNase-Free ddH2O，吹打混勻，充分溶解 RNA。A260/A280為 1.8～2.1，取RNA濃度為25～50 ng/L進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

3．3 引物設(shè)計(jì)與合成 miRBASE數(shù)據(jù)庫(http://www．Mirbase．org/)提供有成熟的 Has-miR-21 和Cel-miR-39序列，見表1，由上海GenePharm公司根據(jù)表1中的序列設(shè)計(jì)特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop)逆轉(zhuǎn)錄引物、PCR擴(kuò)增引物以及 Cel-miR-39雙鏈mimics，見表 2。

表1 Has-miR-21和Cel-miR-39雙鏈mimics的序列Table 1．Sequences for Has-miR-21 and Cel-miR-39 double-stranded mimics

表2 用于擴(kuò)增Has-miR-21和Cel-miR-39的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 2．Real-time fluorescence quantitative PCR primers for amplification of miR-21and Cel-miR-39

3．4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 20μL體系包括5×buffer 4μL，dNTP(10 mmol/L)0.75μL，逆轉(zhuǎn)錄引物(1 mol/μL)1.20μL，MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(2 ×108U/L)0.2 μL，總RNA樣本5μL，剩余體積用 RNase-Free ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)設(shè)1個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件:16℃ 30 min，42℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

3．5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 20μL體系包括2×real time PCR buffer 10 μL(內(nèi)含 3 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTP和SYBR Green I熒光染料)，正、反向特異引物套裝(5 mol/μL)0.32μL，Taq DNA聚合酶(5×106U/L)0.2 μL，cDNA 模板2 μL，剩余體積用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)設(shè)1個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件:95℃ 3 min;95℃12 s，62℃ 50 s，40個(gè)循環(huán)。

3．6 血清miR-21表達(dá)量 相對(duì)表達(dá)量用2－ΔΔCt表示，－ΔΔCt= －［(標(biāo)本 Cttarget－標(biāo)本 CtCel-miR-39)－(對(duì)照Cttarget－對(duì)照 CtCel-miR-39)］，以正常對(duì)照組中miR-21的Ct值為對(duì)照。

3．7 ROC(receiver operating characteristic)曲線 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件以敏感性為縱坐標(biāo)，(1－特異性)為橫坐標(biāo)作圖，繪制ROC曲線。通過ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)大小判斷血清miR-21的診斷效果，其面積一般在0.5～1.0之間。AUC≤0.7時(shí)表示診斷價(jià)值較低;0.7＜AUC≤0.9時(shí)表示診斷價(jià)值中等;AUC＞0.9時(shí)表示診斷價(jià)值較高;AUC接近0.5時(shí)，即ROC曲線接近對(duì)角線，則診斷試驗(yàn)失去臨床意義。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。相對(duì)表達(dá)量成偏態(tài)分布且方差不齊，將2－ΔΔCt進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，經(jīng)K-S檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且具方差齊性(均P＞0.05)。利用單因素方差分析(Oneway ANOVA檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多變量間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。選用Pearson和Spearman相關(guān)分析檢測(cè)血清miR-21表達(dá)水平與其它臨床指標(biāo)的關(guān)系。根據(jù)血清中miR-21的相對(duì)表達(dá)量建立logistic回歸模型，繪制ROC曲線評(píng)價(jià)血清miR-21的診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 熔解曲線和擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證

miR-21熔解曲線約在(77.5±0.7)℃ 呈現(xiàn)單峰;Cel-miR-39熔解曲線約在(82.4±0.6)℃呈現(xiàn)單峰，且均無引物二聚體與其它非特異雜峰存在，陽性反應(yīng)的峰可與陰性、空白對(duì)照明顯區(qū)分開，表明PCR反應(yīng)參數(shù)合適，擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物特異性較好。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，可見80 bp左右單一條帶，見圖1。

Figure 1．Serum miR-21 PCR product electrophoresis for each group．1:20 bp marker;2:normal control;3:diabetes mellitus A patients;4:diabetes mellitus B patients;5:diabetic nephropathy patients;6:uremia patients;7:negative control．圖1 各組血清中miR-21擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2 定量PCR檢測(cè)結(jié)果

各組血清樣本中miR-21及Cel-miR-39的擴(kuò)增反應(yīng)曲線呈標(biāo)準(zhǔn)S型，陰性對(duì)照產(chǎn)生微弱非特異信號(hào)呈不規(guī)則曲線，空白對(duì)照無擴(kuò)增曲線，見圖2。

Figure 2．The amplification curves of real-time fluorescence quantitative PCR for serum miR-21 and exogenous internal reference CelmiR-39 in each group．A～E:Cel-miR-39 curves;F:miR-21 curve of diabetes mellitus A patients;G:miR-21 curve of normal control;H:miR-21 curve of diabetes mellitus B patients;I:miR-21 curve of diabetic nephropathy;J:miR-21 curve of uraemia;K:miR-21 curve of negative control;L:Cel-miR-39 curve of negative control;M:miR-21 curve of blank control;N:Cel-miR-39 curve of blank control．圖2 各組血清中miR-21及外源性內(nèi)參Cel-miR-39的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

3 各組血清中miR-21的表達(dá)水平

經(jīng)單因素方差分析，比較5組間的相對(duì)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=81.92，P＜0.01)，進(jìn)一步使用LSD-t檢驗(yàn)做兩兩比較，正常對(duì)照組血清miRNAs水平顯著低于糖尿病A組，顯著高于其它3組(4組均P＜0.01);糖尿病A組的血清miRNAs水平顯著高于糖尿病B組、糖尿病腎病組以及尿毒癥組(3組均P＜0.01);糖尿病腎病組血清miRNAs水平顯著高于尿毒癥組，顯著低于糖尿病B組(2組均P＜0.01)，見圖3。

4 血清miR-21水平與糖尿病腎病組患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

血清miR-21水平與糖尿病腎病組患者年齡、性別、血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)、尿蛋白 (urinary microprotein，UMTP)以及尿肌酐(urinary creatinine，UCr)無相關(guān)性，但與胱抑素 C(cystatin C，CysC)、UmAlb、Um-Alb/UCr比值呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01，P＜0.05，P ＜0.05)，見表3。

Figure 3．The serum miR-21 expression level in each group．NC:normal control;DMA:diabetes mellitus A patients;DMB:diabetes mellitus B patients;DN:diabetic nephropathy patients;NM:uremia patients．n=25．＊＊P ＜0.01 vs NC;##P ＜ 0．01 vs DMA;△△P ＜0．01 vs DN．圖3 各組血清中miR-21表達(dá)量

5 血清miR-21的診斷價(jià)值

5．1 ROC曲線下面積 根據(jù)建立的Logistic回歸模型計(jì)算血清miR-21的ROC曲線下面積，在DN組+NC組、DN組+DMA組、DN組+DMB組、DN組 +DMA組 +NC組、DN組 +DMB組 +NC組、DN組+DMA組+DMB組、DN組+DMA組+DMB組+NC組，7組人群中診斷糖尿病腎病的AUC分別為0.848(95%CI:0.737～0.959)、0.896(95%CI:0.812～0.980)、0.782(95%CI:0.641 ～0.922)、0.838(95%CI:0.743 ～0.933)、0.796(95%CI:0.675～0.917)、0.808(95%CI:0.704 ～0.911)和0.845(95%CI:0.752～0.939)，見圖4。

表3 血清miR-21水平與糖尿病腎病患者臨床指標(biāo)的關(guān)系Table 3．The association between miR-21 level and clinical parameters in patients with diabetic nephropathy(Mean±SD)

Figure 4．The ROC curves of serum miR-21 in different groups for the diagnosis of diabetic nephropathy．圖4 不同組群血清中miR-21診斷糖尿病腎病的ROC曲線

5．2 診斷效能 根據(jù)不同組群血清中miR-21的相對(duì)表達(dá)量建立的logistic回歸模型，血清miR-21在鑒別DN組與NC組、DMA組、DMB組的敏感性和特異性分別為 80．0%和 72．0%、72．0%和 88．0%、72．0%和 84．0%，準(zhǔn)確性分別為 76.0%、80.0%和78.0%;在鑒別DN組與DMA組+NC組、DMB組+NC組、DMA組+DMB組的敏感性和特異性分別為76．0% 和 77．0%、76．0% 和 82．0%、70．0% 和86．0%，準(zhǔn)確性分別為 76．5%、79.0% 和 78.0%;在DN組+DMA組+DMB組+NC組中診斷糖尿病腎病的的敏感性和特異性分別為76．0%和77．3%，準(zhǔn)確性為76．7%。各組群的Youden指數(shù)(Youden index，YI)介于0～1之間，表明診斷試驗(yàn)真實(shí)性較好，見表4。

討 論

miRNAs是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物對(duì)mRNA的調(diào)節(jié)參與到基因表達(dá)的調(diào)控［5］，Calin等［6］研究發(fā)現(xiàn)，定位于腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域的miRNA達(dá)50%以上，可能具有原癌或抑癌基因的功能，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs表達(dá)異常也參與糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的發(fā)生發(fā)展［7-11］。具有癌基因特征的miR-21已在多種腫瘤疾病中得以深入研究，最近在糖尿病腎病研究領(lǐng)域也開始引發(fā)關(guān)注［12-14］，但目前研究多集中于miR-21在糖尿病腎病動(dòng)物模型或組織細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制與表達(dá)特點(diǎn)，本文首次涉及到血清miR-21的表達(dá)研究。雖然曾健英等［15］報(bào)道3種血清微小RNA檢測(cè)在糖尿病腎病中的作用，但其全血中添加了依地酸二鈉(EDTA-Na2)進(jìn)行抗凝，實(shí)驗(yàn)樣本已不是血清而是血漿。

表4 血清miR-21對(duì)不同組群中糖尿病腎病的診斷效能Table 4．Serum miR-21 diagnostic efficacy for diabetic nephropathy in different groups(%)

本研究用于檢測(cè)血清miR-21表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，需要利用合適的內(nèi)參來消除RNA提取時(shí)樣品間的差異，因此，內(nèi)參的穩(wěn)定性決定著檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前多數(shù)研究選用的內(nèi)參都源自血清本身所含有的miRNAs、snRNA及管家基因等經(jīng)典內(nèi)參［17］，而這些內(nèi)參在血清中的來源尚不明了，含量也遠(yuǎn)不及組織細(xì)胞，甚至在不同的疾病狀態(tài)下表達(dá)量還可發(fā)生變化［16］，給這些內(nèi)參在血清中的表達(dá)帶來了不確定性。人工合成的外源性miRNAs由于人體內(nèi)不曾有該種序列且不受體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響，以此作為內(nèi)參則能很好地解決上述缺陷。因此，本研究選用合成的外源性內(nèi)參Cel-miR-39［17-18］。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在糖尿病腎病患者血清中的表達(dá)量顯著低于正常人以及糖尿病A、B組患者(3組均P＜0．01)，但卻顯著高于有尿毒癥癥狀的患者(P＜0．01)，血清miR-21的這一變化趨勢(shì)與Zhang等［19］在早期糖尿病腎病小鼠腎小球系膜細(xì)胞中的研究結(jié)果一致。血清miR-21的低表達(dá)與CysC、UmAlb、UmAlb/UCr比值有顯著負(fù)相關(guān)性，而與年齡、性別、SCr、BUN、FBG、HbA1c、UMTP 以及UCr沒有相關(guān)性，其中與UmAlb具有顯著負(fù)相關(guān)進(jìn)一步支持了Zhang等認(rèn)為miR-21高表達(dá)可降低尿蛋白排泄率、是糖尿病腎病保護(hù)因素的觀點(diǎn)。Logistic回歸及ROC曲線分析表明血清miR-21在糖尿病腎病和正常組，糖尿病腎病和糖尿病A組，糖尿病腎病和糖尿病B組，糖尿病腎病和糖尿病A組及正常組，糖尿病腎病和糖尿病B組及正常組，糖尿病腎病和糖尿病A組及糖尿病B組，糖尿病腎病和糖尿病A組、糖尿病B組及正常組等7組人群中診斷糖尿病腎病具有較好的實(shí)用價(jià)值，且在7組人群中診斷糖尿病腎病的ROC-AUC、敏感性和特異性都較為理想，說明miR-21或可作為糖尿病腎病的潛在分子診斷指標(biāo)。另外值得注意的是，我們首次發(fā)現(xiàn)血清miR-21在糖尿病A組中較正常組顯著升高(P＜0.01)，一旦患者UmAlb超出正常，血清 miR-21的表達(dá)則開始迅速下降，隨著病情發(fā)展直到尿毒癥癥狀出現(xiàn)，血清miR-21一直趨于降低。與此類似，Szeto等［20］認(rèn)為糖尿病腎病引起的CKD患者尿沉渣中miR-21表達(dá)量與腎小球?yàn)V過率呈正相關(guān)，尿沉渣中有高含量miR-21的患者血透生存期較長(zhǎng)，證明高表達(dá)的miR-21或許是糖尿病腎病的保護(hù)因素，同時(shí)還提示miR-21或可在糖尿病患者中預(yù)測(cè)糖尿病腎病的發(fā)生，對(duì)糖尿病腎病的早期診斷具有一定的提示作用，還可作為評(píng)估糖尿病腎病患者病情的一項(xiàng)潛在分子指標(biāo)。

就目前糖尿病腎病的診斷與治療現(xiàn)狀而言，如何提高糖尿病腎病早期診斷水平仍然是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的問題。近來的研究認(rèn)為在糖尿病腎病模型的腎臟組織、細(xì)胞中具有特異miRNAs表達(dá)譜的變化特征，雖然組織細(xì)胞中的miRNAs表達(dá)譜可能與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，但檢測(cè)手段繁雜、極具創(chuàng)傷性，不便于臨床診斷的開展。較之而言，外周循環(huán)中的血清有著應(yīng)用簡(jiǎn)便，創(chuàng)傷微小，利于推廣等優(yōu)勢(shì)。而且血清中miRNAs能經(jīng)受RNA酶降解，在煮沸、酸堿、反復(fù)凍融、長(zhǎng)期保存等嚴(yán)酷環(huán)境下仍可穩(wěn)定存在［21］。本研究采用SYBR Green I熒光定量 PCR檢測(cè)血清miR-21，操作快速、簡(jiǎn)單，且成本低廉，僅需200μL血清即可完成定量測(cè)定。我們的研究結(jié)果，提示了血清miR-21可能在糖尿病腎病診斷中起到重要作用，至于何種機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有理由相信，隨著miRNAs在糖尿病腎病研究領(lǐng)域的廣泛深入，血清miRNAs應(yīng)用于診斷糖尿病腎病可提高對(duì)其的診治水平，改善預(yù)后。