王全勝， 尹紅霞， 張阿麗， 陳建武， 盧芙蓉， 薛卡明， 謝紀(jì)文， 劉建國， 李仁康， 鄧安國

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院1中西醫(yī)結(jié)合科，4腎內(nèi)科，湖北武漢430022;2荊州市婦幼保健院，湖北荊州434000;3武漢大學(xué)中南醫(yī)院放化療科，湖北武漢430071)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因，而足突細(xì)胞病變包括足突脫離腎小球基底膜和上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)在DN進(jìn)展中起重要作用［1-2］。轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)在 DN 腎臟中高表達(dá)［3-4］，是 EMT 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。另外，炎癥在DN進(jìn)展中起重要作用［5-7］，是DN治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)，抑制腎組織中巨噬細(xì)胞的浸潤能減輕DN腎臟的炎癥［8-9］。

臨床的研究顯示，n-3不飽和脂肪酸能抗急性或慢性炎癥［10］。保護(hù)素D1(protectin D1，PD1)是來源于n-3不飽和脂肪酸的脂蛋白，有抗炎癥作用，能減少腎臟急性缺血/再灌注損傷［11-12］。因此，我們推測PD1可能通過抑制腎臟炎癥和足突細(xì)胞EMT而減少早期DN小鼠腎纖維化。為證實(shí)該假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)觀察PD1對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的早期DN小鼠的治療作用等，體外觀察PD1對TGF-β1誘導(dǎo)小鼠足突細(xì)胞EMT的抑制作用以及其對高糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的抑制作用。

材料和方法

1 動物及細(xì)胞株

武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供的清潔級C57BL/6J雌性小鼠飼養(yǎng)在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264．7購自ATCC。永生化小鼠足突細(xì)胞系第12代由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Peter Mundel教授惠贈。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素(Sigma)，PD1(Cayman)，抗 F4/80抗體(Santa Cruz Biotechnology)，Cy5標(biāo)記純化的Ⅱ抗 (Jackson Lab)，Hoechst 33342(Sigma)，胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)，肌酐酶學(xué)分析試劑盒(Thermo Scientific)，TNF-α 和IL-1β ELISA 檢測試劑盒(Biolegend)，TGF-β1(Cell Signaling Technology)，抗成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP1)抗體(Millipore)，抗纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)抗體(Santa Cruz Biotechnology)，抗zonula occludens-1(ZO-1)抗體(Invitrogen)，抗 P-cadherin抗體(Antibodies-Online)，抗 α-平滑肌肌動蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)抗體(Abcam)和抗 βactin抗體(Sigma)。

3 主要方法

3．1 動物實(shí)驗(yàn)與分組 8周齡小鼠空腹18 h后，連續(xù)2 d兩次腹腔注射鏈脲佐菌素(125 mg/kg溶解于pH 4．5檸檬酸緩沖液中)。正常對照組腹腔注射等量生理鹽水。注射藥物5～7 d后，檢測全血血糖(ACCU-CHEK Meter，Roche Diagnostics)，凡隨機(jī)血糖超過300 mg/dL視為糖尿病誘導(dǎo)成功，此后每周定期監(jiān)測血糖。小鼠隨機(jī)分為以下3組:正常對照組、DN組和PD1治療(DN+PD1)組，每組6只小鼠。糖尿病造模成功后，PD1治療組小鼠每天腹腔注射PD1(0．08 mg/kg)，共8周，其它組用等量無菌生理鹽水對照。PD1的劑量與用藥方式參見文獻(xiàn)［11-12］。

治療8周后，用代謝籠收集每只小鼠24 h尿量，檢測24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白和尿肌酐。頸椎脫臼處死各組小鼠，稱量小鼠體重和腎重量，同時取血測空腹及隨機(jī)血糖和血清肌酐。同時，取左腎一半在4%多聚甲醛固定24 h，后進(jìn)行石蠟包埋及切片。左腎剩余部分用4%多聚甲醛固定2 h，后在4℃、30%PBS配制的蔗糖中沉降過夜，在OCT包埋劑中包埋－80℃保存以備冰凍切片之用。參照文獻(xiàn)［13］的方法，通過系列篩網(wǎng)分離右腎腎小球，保存在－80℃，為蛋白質(zhì)檢測準(zhǔn)備。

3．2 代謝指標(biāo)的檢測 糖尿病模型成功后，檢測各組小鼠第1及8周末體重和空腹血糖，在8周末檢測腎重/體重比、24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白和肌酐清除率。參見文獻(xiàn)［14］，用Bradford方法檢測24 h尿蛋白。用ELISA試劑盒(Exocell)檢測24 h尿白蛋白。用肌酐酶學(xué)分析試劑盒(Thermo Scientific)檢測尿及血清肌酐。按照文獻(xiàn)的方法［15-16］［24 h尿肌酐 (μg/24 h)÷血清肌酐濃度(g/L)÷1 440(24 h轉(zhuǎn)化為min)÷體重(g)］計(jì)算肌酐清除率。

3．3 腎組織過碘酸 － 雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色分析 對石蠟包埋的腎臟切片(4μm厚)進(jìn)行PAS染色，參見文獻(xiàn)［17-18］的方法，應(yīng)用 ImageJ圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。每張切片在400倍光鏡下取50個完整腎小球，計(jì)算腎小球系膜基質(zhì)相對面積(即腎小球系膜基質(zhì)/腎小球面積比)。

3．4 腎組織間接免疫熒光染色分析 對腎組織冰凍切片做間接免疫熒光染色，參考文獻(xiàn)的方法［19］，冰凍切片(5μm厚)在4%多聚甲醛中固定，后在PBS配制的1%Triton X-100中孵育，再用10%正常羊血清封閉30 min，加入F4/80的Ⅰ抗，隨后加入Cy5標(biāo)記純化的Ⅱ抗 (1∶100，Jackson Lab)。設(shè)非免疫性的IgG為Ⅰ抗的陰性對照，無染色反應(yīng)(圖片省略)。用Hoechst 33342(1∶1 000，Sigma)對細(xì)胞核染色，對腎皮質(zhì)中F4/80陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每高倍鏡下每張切片觀察10個視野。

3．5 PD1對高糖作用下RAW264．7細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介 素 1β (interleukin 1β，IL-1β) 的 影 響>RAW264．7細(xì)胞培養(yǎng)在含 5．5 mmol/L葡萄糖和10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(6孔板)中，達(dá)到80%融合后，用含0．5% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，準(zhǔn)備開始檢測。為檢測PD1效應(yīng)，在不同濃度的葡萄糖 (5．5、25和50 mmol/L)刺激下，加入或不加PD1(200 nmol/L)作用18 h。同時，設(shè)葡萄糖(5．5 mmol/L)加甘露醇 (44．5 mmol/L)為高滲透壓對照。收集培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測TNF-α和IL-1β。每項(xiàng)檢測，都獨(dú)立重復(fù)3次以上。

3．6 PD1對小鼠足突細(xì)胞EMT的抑制作用 永生化小鼠足突細(xì)胞系第12代按Peter Mundel教授報(bào)道的方法培養(yǎng)［20-21］。小鼠足突細(xì)胞培養(yǎng)在包被1型膠原的培養(yǎng)板中，用含小鼠interferon-γ(5×104U/L)和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。后去掉interferon-γ，在37℃培養(yǎng)10～14 d分化成熟。當(dāng)80%細(xì)胞融合后，用含2%胎牛血清的RPMI-1640在37℃過夜。用TGF-β1(2．0μg/L)刺激細(xì)胞，同時添加或不添加 PD1(50 nmol/L或400 nmol/L)。設(shè)未添加TGF-β1為正常對照組。處理48 h后，用RIPA蛋白裂解液提取各組細(xì)胞胞漿蛋白，為Western blotting檢測目的蛋白準(zhǔn)備。

3．7 Western blotting 檢測 參照文獻(xiàn)［22-23］，用Western blotting對細(xì)胞或腎小球中目的蛋白進(jìn)行檢測。分別加入下列Ⅰ抗:抗FSP1、抗FN、抗ZO-1、抗P-cadherin、抗 α-SMA和抗 β-actin抗體。加入 LICOR公司的熒光標(biāo)記Ⅱ抗檢測，并用Odyssey Imaging System(LI-COR)掃描定量。每項(xiàng)檢測，都獨(dú)立重復(fù)3次以上。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。用SPSS12．0軟件One-way ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PD1減輕糖尿病腎病小鼠代謝指標(biāo)的紊亂

糖尿病模型成功第1及8周末，各組血糖及血清肌酐水平無顯著差異。與正常對照組小鼠相比較，DN組小鼠24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白、腎重和腎重/體重比顯著增加。與DN組小鼠比較，PD1治療組小鼠中，它們的增加受到抑制。與正常對照組小鼠比較，DN組小鼠8周末的肌酐清除率顯著增加，這符合早期DN的特征［24］。與DN組小鼠相比，PD1治療組小鼠肌酐清除率的增加受到抑制，見表1。這說明PD1治療減輕了DN小鼠的代謝異常。

2 PD1減輕DN小鼠腎小球系膜基質(zhì)的積聚

與正常對照組小鼠相比較，DN組小鼠腎小球系膜基質(zhì)顯著積聚。與DN組小鼠比較，PD1治療組中該系膜基質(zhì)的積聚被顯著抑制(12．50% ±0．53%vs 16．80% ±1．05%，P ＜0．01)，見圖1。

表1 糖尿病1周或8周末各組小鼠代謝指標(biāo)Table 1．Metabolic data of C57BL/6Jmice at the end of 1 or 8 weeks of diabetes(Mean±SEM．n=6)

Figure 1．PD1 attenuated glomerular mesangial matrix accumulation in DN mice(PAS staining，× 400)．Mean ±SEM．n=6．＊＊P ＜0．01 vs DN．圖1 PD1減輕早期DN小鼠腎小球系膜基質(zhì)積聚

3 PD1抑制DN小鼠腎小球中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA和FN的表達(dá)，恢復(fù)其足突細(xì)胞丟失的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達(dá)

與正常對照組小鼠比較，DN組小鼠腎小球中α-SMA和FN的表達(dá)顯著增加;與DN組小鼠比較，PD1治療組腎小球中α-SMA和FN的表達(dá)被顯著抑制，見圖2。與正常對照組小鼠比較，DN組小鼠腎小球中足突細(xì)胞的特異性上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達(dá)顯著減少;與DN組小鼠比較，PD1治療組小鼠腎小球中足突細(xì)胞的特異性上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達(dá)顯著增加，見圖2。這些結(jié)果顯示，PD1能抑制DN腎小球中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白FN和α-SMA的表達(dá)，恢復(fù)DN中足突細(xì)胞丟失的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達(dá)。

4 PD1減輕DN小鼠腎皮質(zhì)中巨噬細(xì)胞的浸潤

與正常對照組小鼠比較，DN組小鼠腎皮質(zhì)F4/80陽性細(xì)胞顯著增加(P＜0．01)。與DN組小鼠比較，PD1組小鼠腎皮質(zhì)F4/80陽性細(xì)胞顯著減少(P ＜0．01)，見圖3。

5 PD1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的足突細(xì)胞EMT

TGF-β1(2μg/L)刺激足突細(xì)胞后，細(xì)胞由圓盤形變成拉長的梭形，PD1(400 nmol/L)能抑制其形態(tài)的改變，見圖4。Western blotting顯示，與正常組細(xì)胞比較，TGF-β1(1μg/L)促進(jìn)其間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白FSP1和α-SMA的表達(dá)，抑制其特異性上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白P-cadherin和ZO-1的表達(dá);PD1(400 nmol/L)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的 FSP1和α-SMA表達(dá)上調(diào)，恢復(fù)其誘導(dǎo)的P-cadherin和ZO-1表達(dá)減少，見圖5。

6 PD1抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264．7細(xì)胞過分泌TNF-α和IL-1β蛋白

與正常糖(5．5 mmol/L)比較，RAW264．7 細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的能力與高糖的濃度呈劑量依賴性，見圖6A;與正常糖(5．5 mmol/L)比較，RAW264．7 細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的能力也與高糖的濃度呈劑量依賴性，見圖6B。甘露醇高滲透壓對照組細(xì)胞不影響細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β的能力，見圖6A、B。

討 論

大量研究表明，腎臟的炎癥在DN的進(jìn)程中起重要作用［5-6］。在DN患者腎活檢標(biāo)本中，巨噬細(xì)胞的積聚及細(xì)胞間黏附因子的表達(dá)顯著增加［7］，而DN腎臟中巨噬細(xì)胞與腎間質(zhì)成纖維母細(xì)胞的積聚及纖維化、蛋白尿、腎功能的下降顯著正相關(guān)［25-26］，而通過基因敲除巨噬細(xì)胞清除受體A及抑制細(xì)胞間黏附因子1能抑制DN小鼠腎臟的炎癥反應(yīng)［8-9］。因此，DN被認(rèn)為是以巨噬細(xì)胞浸潤及炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生為特征的腎臟炎癥過程。

PD1是來源于n-3不飽和脂肪酸的脂蛋白，有抗炎癥作用，能減少腎臟急性缺血/再灌注損傷［11-12］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，PD1能抑制DN小鼠腎臟的巨噬細(xì)胞浸潤，能抑制高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α。同時，PD1抑制DN小鼠腎小球系膜基質(zhì)的積聚及FN的表達(dá)。因此，PD1抗炎癥效應(yīng)參與了其抑制DN腎小球纖維化，是其抑制DN腎小球纖維化的作用機(jī)制之一。

Figure 2．PD1 inhibited glomerularα-SMA and FN expression，and recovered podocyte epithelial markers ZO-1 and P-cadherin expression in DN mice．Mean ± SEM．n=6．＊＊P ＜0．01 vs DN．圖2 PD1抑制DN小鼠腎小球中α-SMA和FN的表達(dá)，恢復(fù)DN中足突細(xì)胞丟失的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達(dá)

Figure 3．PD1 reduced renal cortical macrophage accumulation in DN mice［renal cortical F4/80 positive macrophages(red)and nuclear Hoechst staining(blue)，×200］．Mean ±SEM．n=6．＊＊P ＜0．01 vs DN．圖3 PD1減輕DN小鼠腎皮質(zhì)中巨噬細(xì)胞的浸潤

Figure 4．PD1 inhibited podocyte EMT morphological changes(×200)．N:normal group;PD1:PD1(400 nmol/L)group;TGF-β1:TGF-β1(2 μg/L)group;TGF-β1+PD1:TGF-β1(2 μg/L)+PD1(400 nmol/L)group．Scale bars:40 μm．圖4 PD1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的足突細(xì)胞EMT形態(tài)學(xué)改變

TGF-β1在 DN 中高表達(dá)［3-4］，是 EMT 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而EMT參與DN腎纖維化進(jìn)程。在本研究體外實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)PD1能以劑量依賴性方式抑制TGF-β1誘導(dǎo)的足突細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白FN、FSP1和α-SMA，能恢復(fù) TGF-β1抑制的足突細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白P-cadherin和ZO-1的表達(dá)。足突細(xì)胞特異性上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白ZO-1是其裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)區(qū)重要組成成分，ZO-1的丟失能導(dǎo)致其去分化以及SD區(qū)完整性的損傷［27-28］。P-cadherin是SD區(qū)核心蛋白分子，它的減少與早期DN腎臟病變及蛋白尿的進(jìn)展密切相關(guān)［29］。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，PD1能抑制DN腎小球中ZO-1和P-cadherin表達(dá)的減少，抑制DN腎小球中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA和FN的增加，與體外的研究結(jié)果是一致的。據(jù)報(bào)道，在早期DN中足突細(xì)胞沒有脫落或凋亡，表明足突細(xì)胞的脫落不是蛋白尿發(fā)生的啟動因素［2］。因此，PD1對DN中足突細(xì)胞損傷的保護(hù)，是通過抑制DN引起的足突細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白ZO-1和P-cadherin的減少及其間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白FSP1、FN和α-SMA的增加而實(shí)現(xiàn)的。PD1可能通過抑制足突細(xì)胞EMT，從而減輕DN腎小球纖維化。

總之，PD1能抑制早期DN小鼠的腎小球纖維化，其機(jī)制可能與PD1抑制腎臟的炎癥反應(yīng)和足突細(xì)胞EMT有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為今后應(yīng)用PD1及其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似物防治DN腎小球纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 6．PD1 inhibited the increases in TNF-α (A)and IL-1β (B)production in RAW264．7 cells induced by high glucose．RAW264．7 cells were seeded in 24-well plates under high D-glucose condition with or without PD1(200 nmol/L)for 18 h．Controls are normal D-glucose group(NG，5．5 mmol/L)，normal D-glucose+mannitol group(MA，5．5 mmol/L+44.5 mmol/L)，HG1 group(high D-glucose，25 mmol/L)，and HG2 group(high D-glucose，50 mmol/L)．The culture medium was analyzed by ELISA for RAW264．7-secreted TNF-α and IL-1β proteins．Mean ± SEM．n=3．＊＊P ＜0．01 vs HG2;#P ＜0．05，##P ＜0．01 vs HG1．圖6 PD1抑制高糖誘導(dǎo)的RAW264．7巨噬細(xì)胞過分泌TNF-α和IL-1β蛋白