劉 嬋， 商黔惠，2△， 石耿輝， 趙 宇， 祝之明

(遵義醫(yī)學(xué)院1臨床醫(yī)學(xué)研究所，心血管病研究所，高血壓研究室，2附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 遵義563000;3第三軍醫(yī)大學(xué)全軍高血壓代謝病中心，重慶市高血壓研究所，重慶大坪醫(yī)院高血壓內(nèi)分泌科，重慶400042)

高鹽是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的重要環(huán)境因素之一。長期高鹽飲食不僅導(dǎo)致血壓升高，而且有獨(dú)立于血壓之外的多重作用，可直接導(dǎo)致血管、心臟及腎臟等組織器官纖維化［1-2］，但其機(jī)制尚未完全明了。心肌成纖維細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度的上升是觸發(fā)心肌纖維化及重構(gòu)的重要因素，通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)信號(hào)通路的激活，使心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成增加［3］，但介導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的通道尚不明確。瞬時(shí)受體電位通道C亞族(transient receptor potential channels subfamily C，TRPCs)是一類新型的細(xì)胞膜表面通道蛋白，在心臟和血管均有表達(dá)，能介導(dǎo)Ca2+和Na+的內(nèi)流，由于TRPC通道電導(dǎo)較小及可以長時(shí)程傳遞Ca2+信號(hào)的特性，使其成為心血管系統(tǒng)最具研究前景的鈣內(nèi)流通道［4-7］。Ohba等［8］和 Onohara 等［9］通過應(yīng)用內(nèi)皮素1和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)刺激新生大鼠心肌細(xì)胞建立心肌肥大模型，發(fā)現(xiàn)TRPC1、TRPC3與TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，干擾RNA抑制這些基因表達(dá)能明顯抑制心肌細(xì)胞肥大時(shí)發(fā)生的肌動(dòng)蛋白重組及蛋白合成，說明TRPC通道蛋白在心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但TRPC在高鹽誘導(dǎo)心肌纖維化中的作用尚不清楚。核因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一種核蛋白因子，參與眾多與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。有研究發(fā)現(xiàn)TRPC3介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流增加后，也可通過CaN活化NF-κB，導(dǎo)致促纖維化炎癥因子、血管細(xì)胞黏附因子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)表達(dá)升高［10-12］，但炎癥在高鹽誘導(dǎo)左心室纖維化中的作用及機(jī)制是否與激活TRPC及其下游信號(hào)分子CaN、NF-κB有關(guān)，目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對TRPC1、TRPC3、TRPC6及炎癥分子表達(dá)的研究，進(jìn)一步探討TRPC和炎癥在高鹽飲食致左室纖維化中的作用及替米沙坦的干預(yù)效應(yīng)。

材料和方法

1 材料

雄性Wistar大鼠由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)為SCXK-(渝)2007-005］;含NaCl分別為0．5%和8%的顆粒飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)為SCXK-(粵)2008-0002］;替米沙坦由海南賽力克藥業(yè)有限公司惠贈(zèng);TRPC1、TRPC3和 TRPC6Ⅰ抗購自 Alomone labs(第三軍醫(yī)大學(xué)祝之明教授饋贈(zèng))，CaN、p-NF-κB p65、白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)和轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)Ⅰ抗購自Santa Cruz，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，Trizol試劑購自 Invitrogen。

2 方法

2．1 模型的建立與分組［17］Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組:正常對照組(C組)13只、高鹽模型組(HS組)24只和替米沙坦干預(yù)組(T組)12只。C組飼以正常鹽飼料(0．5%NaCl)，HS組飼以8%高鹽飼料，T組飼以8%高鹽飼料，并給予替米沙坦灌胃，替米沙坦起始劑量2 mg/kg，隨后根據(jù)血壓情況每2周調(diào)整1次劑量，使血壓盡量控制在正常范圍內(nèi)，替米沙坦最大劑量至40 mg/kg。各組大鼠均在相同標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲用自來水，飼養(yǎng)24周。

2．2 血壓測定 用BESN-Ⅱ多通道動(dòng)物無創(chuàng)測壓儀測量大鼠尾動(dòng)脈壓，每只大鼠測量3次，取其平均值作為該大鼠該次的尾動(dòng)脈壓。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始測壓，作為基礎(chǔ)壓，隨后每2周測量1次。高血壓大鼠判定標(biāo)準(zhǔn):處理后血壓增加20～30 mm-Hg且 ＞120 mmHg。

2．3 左室重量指數(shù)測定 打開大鼠胸腔，沿升主動(dòng)脈根部剪掉心臟，以房間隔和室間隔為界去除心房及右心室游離緣，冰生理鹽水簡單沖洗后濾紙吸干，使用電子分析天平準(zhǔn)確稱取左室重量(含室間隔)，計(jì)算大鼠左室重量指數(shù)。

2．4 HE和Masson染色判定左心室重構(gòu)

2．4．1 HE染色 組織經(jīng)固定24 h后，進(jìn)行脫水、透明及石蠟包埋。脫蠟至水，蘇木素染液3～4 min，自來水(流水)沖洗30 s，1%鹽酸乙醇分化返藍(lán)2～3 s，自來水(流水)沖洗5 ～10 min，伊紅染液 2 min，自來水(流水)沖洗30 s，95%乙醇數(shù)秒，95%乙醇數(shù)秒，無水乙醇數(shù)秒，烤箱烤干，60℃ 3～5 min，中性樹膠封片。

2．4．2 Masson染色 取左心室固定24 h后，進(jìn)行脫水、透明及石蠟包埋。石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染液7 min，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗，麗春紅酸性復(fù)紅染色30 min，0．5%冰乙酸沖洗，1%磷鉬酸數(shù)秒，0．5%冰乙酸沖洗，2%亮綠染色1 min，烤箱烤干(60℃ 3～5 min)，中性樹膠封片。Masson染色使膠原纖維呈綠色，肌纖維和彈力纖維呈紅色。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野，拍照記錄。用Image-Pro Plus 6．0軟件分析，測量左心室膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF為膠原面積與記錄區(qū)域總面積的比值，每個(gè)標(biāo)本取5個(gè)視野的均值作為其結(jié)果。

2．5 左心室TRPCs、NF-κB p65和促炎細(xì)胞因子實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 用Trizol試劑提取大鼠左心室總RNA，隨后按Trizol試劑盒說明書對RNA進(jìn)行純化，紫外分光光度計(jì)測定樣本在260和280 nm的吸光度值(A260和 A280)，所得 A260/A280在1．80 ～ 2．20之間認(rèn)為純度符合要求。配置40μL 50 mg/L RNA逆轉(zhuǎn)錄液，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果以目的基因/β-actin的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2．6 Western blotting 法檢測左心室 TRPCs、CaN、p-NF-κB p65和促炎細(xì)胞因子蛋白表達(dá) 左心室心肌組織在RIPA裂解液中勻漿，冰上放置30 min以充分裂解，4℃、12 000 r/min離心10 min后分離上清，測定蛋白濃度(BCA方法)。各樣本取相同的蛋白量(100μg)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，先用電壓60 V，到達(dá)分離膠時(shí)加大電壓至100 V，電泳完成后，把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(電壓110 V，電轉(zhuǎn)90 min左右)，TBST洗膜，5%脫脂牛奶封閉，TBST洗膜，Ⅰ抗4℃孵育過夜(Ⅰ抗的濃度:TRPC1 1∶200、TRPC3 1∶200、TRPC6 1∶200、CaN 1∶1 000 p-NF-κB p65 1∶1 000、IL-1β 1 ∶1 000、TGF-β11 ∶1 000、β-actin 1∶1 000)，TBST洗膜，室溫孵育相應(yīng)的Ⅱ抗 2 h，TBST洗膜，將ECL化學(xué)發(fā)光試劑加在膜表面后，放入Bio-Rad凝膠成像儀中，選擇化學(xué)發(fā)光，開始曝光檢測蛋白表達(dá);采用Quantity One定量分析軟件系統(tǒng)對圖像進(jìn)行積分吸光度測定。通過目的蛋白的積分吸光度值除以內(nèi)參照β-actin的積分吸光度值，得到各組蛋白條帶相對值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，方差齊使用LSD法，方差不齊使用Tamhane's T2法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠血壓和左室重量指數(shù)

與C組和T組相比，HS組尾動(dòng)脈收縮壓和頸動(dòng)脈平均壓明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，其余各組之間比較無顯著差異，見表1。HS組左室重量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)與 C組相比顯著增高(P＜0．05)，T組 LVMI降低(P＜0.05)，見表 1。

表1 各組大鼠血壓及左室重量指數(shù)比較Table 1．The comparison of blood pressure and LVMI in variousgroups(Mean±SD)

2 大鼠左心室HE染色和Masson染色

2．1 HE染色 與C組比較，HS組細(xì)胞水腫，直徑增大，間質(zhì)細(xì)胞增多，有炎癥細(xì)胞浸潤;與HS組比較，T組細(xì)胞直徑相對較小，間質(zhì)細(xì)胞減少，炎癥細(xì)胞浸潤較少，見圖1。

Figure 1．HE staining of left ventricular tissues from various groups(×400)．圖1 各組大鼠左心室Masson染色

2．2 Masson染色 心肌細(xì)胞胞漿呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。與C組比較，HS組膠原容積分?jǐn)?shù)增高(P＜0．05);T組膠原容積分?jǐn)?shù)低于 HS組(P＜0．05)，見圖2。

Figure 2．Masson staining of left ventricular tissues from various groups(× 400)．CVF:collagen volume fraction．Mean±SD．n=6．*P ＜0．05 vs Cgroup;#P ＜0．05 vs T group．圖2 各組大鼠左心室Masson染色

3 大鼠左心室TRPCs、NF-κB p65和促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況

采用real-time PCR檢測大鼠左心室TRPC1、TRPC3、TRPC6、NF-κB p65、TGF-β1、VCAM-1、細(xì)胞間黏附分子 1(intercellular adhesion molecular，ICAM-1)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與C組比較，HS組TRPC1、TRPC3、TRPC6、NF-κB p65、TGF-β1、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1 mRNA表達(dá)增高(P＜0.05);經(jīng)替米沙坦干預(yù)后，TRPC1、TRPC3、TRPC6、NF-κB p65、TGF-β1、ICAM-1 和 MCP-1 mRNA 表 達(dá) 下降(P ＜0．05)，表 2。

4 各組大鼠左心室TRPCs蛋白表達(dá)情況

Western blotting結(jié)果表明，HS組TRPC1、TRPC3和TRPC6蛋白表達(dá)明顯高于 C組(P＜0．01，P＜0.01，P ＜0．05);替米沙坦治療后 TRPC1、TRPC3 和TRPC6蛋白表達(dá)明顯減少(P ＜0．01，P ＜0．01，P ＜0．05)，見圖3。

表 2 各組大鼠左心室 TRPC1、TRPC3、TRPC6、NF-κB p65、TGF-β1、IL-1β、VCAM-1、ICAM-1 和 MCP-1 mRNA 表達(dá)Table 2．The mRNA expression of TRPC1，TRPC3，TRPC6，NF-κB p65，TGF-β1，IL-1β，VCAM-1，ICAM-1 and MCP-1 in left ventricular tissue from various groups(Mean±SD．n=6)

Figure 3．The protein expression of TRPC1，TRPC3 and TRPC6 in left ventricular tissues from various groups．Mean ±SD．n=6．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs Cgroup;#P ＜0．05，##P ＜0．01 vs T group．圖3 各組大鼠左心室TRPC1、TRPC3和TRPC6蛋白表達(dá)

5 各組大鼠左心室CaN、p-NF-κB p65和促炎癥細(xì)胞因子蛋白表達(dá)情況

與C組比較，HS組左心室 CaN、p-NF-κB p65、TGF-β1和 IL-1β 表達(dá)增高(P ＜0．05);經(jīng)替米沙坦干預(yù)后，p-NF-κB 和 TGF-β1表達(dá)下降(P ＜0．05)，CaN 和IL-1β 表達(dá)無顯著差異(P ＞0．05)，見圖4、5。

討 論

心肌纖維化是指在病理狀態(tài)下心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)沉積異常增加，心肌結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生重構(gòu)。目前國內(nèi)外研究表明，心肌纖維化的發(fā)生與其介導(dǎo)的腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活，氧化應(yīng)激水平升高，炎性反應(yīng)增強(qiáng)和內(nèi)皮功能失調(diào)有關(guān)［1，13-15］。Ferreira 等［1］人發(fā)現(xiàn)高鈉鹽喂養(yǎng) Wistar大鼠18周后，可引起心肌間質(zhì)纖維化;高鹽飲食還可引發(fā)鹽敏感大鼠局部組織(心臟、腎臟、血管等)炎癥反應(yīng)、纖維化及器官損傷［16］。研究發(fā)現(xiàn)，壓力負(fù)荷增加可導(dǎo)致心肌肥大和細(xì)胞外基質(zhì)集聚，能激發(fā)心肌的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子表達(dá)，介導(dǎo)心肌纖維化。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)長期8%高鹽飲食可導(dǎo)致正常Wistar大鼠心肌間質(zhì)纖維化，高鹽組與對照組相比左心室組織有炎癥細(xì)胞浸潤，并伴隨促炎癥細(xì)胞因子TGF-β1、IL-1β、VCAM-1、ICAM-1 和 MCP-1 mRNA 或相關(guān)蛋白表達(dá)的增高，推測局部組織炎癥可能參與鹽誘導(dǎo)的大鼠左心室纖維化發(fā)生機(jī)制。

心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化是觸發(fā)心肌纖維化及重構(gòu)的始動(dòng)因素，根據(jù)TRPC通道電導(dǎo)較小及可以長時(shí)程傳遞Ca2+信號(hào)的特性，使其成為心血管系統(tǒng)最具研究前景的鈣內(nèi)流通道，Bush等［3］通過研究3種大鼠心肌肥大模型(自發(fā)性高血壓大鼠、胸主動(dòng)脈縮窄大鼠以及去甲腎上腺素刺激的大鼠)發(fā)現(xiàn)心臟組織TRPC3蛋白表達(dá)明顯增加;將TRPC3基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞，細(xì)胞體積增大，應(yīng)用TRPC通道激動(dòng)劑刺激此轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞后，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大［6］;應(yīng)用血管緊張素Ⅱ刺激新生大鼠心肌細(xì)胞建立心肌肥大模型，發(fā)現(xiàn)TRPC1、TRPC3與TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加［7-9］，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TRPC通道蛋白在心肌肥厚過程中扮演重要角色，但TRPC在高鹽飲食致心肌纖維化中的作用知之甚少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明高鹽可使大鼠左心室TRPC1、3、6 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，提示TRPC的異常表達(dá)也參與了高鹽飲食致左心室纖維化的過程。TRPC介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流增加后，可通過CaN使NF-κB活化，導(dǎo)致促纖維化炎癥因子VCAM-1表達(dá)升高［11］;NF-κB是一種多向性轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種細(xì)胞凋亡、增殖相關(guān)基因，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、自由基等炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生，引發(fā)相應(yīng)的病變［10-13］。我們的結(jié)果顯示高鹽飲食可上調(diào)CaN和p-NF-κB p65及促纖維化炎細(xì)胞因子MCP-1、VCAM-1、ICAM-1、IL-1β和TGF-β1的表達(dá)，提示高鹽飲食可能通過激活CaN及NF-κB轉(zhuǎn)錄促纖維化炎癥因子，引發(fā)左心室組織炎癥，導(dǎo)致纖維化。

Figure 4．The protein expression of CaN，p-NF-κB p65 in left ventricular tissues from various groups．Mean ±SD．n=6．*P ＜0．05 vs C group;#P ＜0．05 vs T group．圖4 各組大鼠左心室CaN和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)

Figure 5．The protein expression of TGF-β1 and IL-1β in left ventricular tissues from various groups．Mean ± SD．n=6．*P ＜0．05 vs C group;#P ＜0．05 vs T group．圖5 各組大鼠左心室TGF-β1和IL-1β蛋白表達(dá)

大量研究證實(shí)，心臟局部組織的RAAS對心肌纖維化起重要作用，其效應(yīng)分子——AngⅡ和醛固酮(aldosterone，ALD)則是引起心肌纖維化最主要的活性物質(zhì)。高鈉鹽飲食能增加WKY大鼠心肌血管緊張素Ⅱ1型(angiotensinⅡ type 1，AT1)受體mRNA表達(dá)和ALD合成［16］，ALD拮抗劑螺內(nèi)酯可以預(yù)防高鹽飲食引起的心肌膠原合成增加和纖維化［17］。高鈉鹽喂養(yǎng)Wistar大鼠18周后，可引起心肌間質(zhì)纖維化，纖維化組織中AT1受體密度明顯上升［1］，導(dǎo)致心臟、血管、腎臟的廣泛纖維化［18］。AngⅡ與AT1受體結(jié)合后，可激活細(xì)胞膜TRPC通道引發(fā)Ca2+內(nèi)流［19-20］。研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦能通過阻斷AT1受體減弱TNF-α誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)［21］，在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，AngⅡ與血管平滑肌細(xì)胞表面AT1受體結(jié)合，激活NF-κB，使巨噬細(xì)胞浸潤，白細(xì)胞黏附因子及MCP-1高表達(dá)，應(yīng)用AT1受體阻斷劑或血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可顯著減少單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)，抑制 NF-κB 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄［12］，提示替米沙坦可能通過影響TRPC介導(dǎo)的下游炎癥反應(yīng)，發(fā)揮療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示替米沙坦能改善左心室的炎癥及纖維化，抑制 TRPC1、TRPC3、TRPC6、p-NFκB p65 及促纖維化炎癥因子表達(dá)，表明替米沙坦可影響TRPCs表達(dá)與NF-κB的激活發(fā)揮抗左心室纖維化作用。

綜上所述，局部組織炎癥可能參與鹽誘導(dǎo)的大鼠左心室纖維化發(fā)生機(jī)制，炎癥的激活與TRPCs、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)，替米沙坦可通過影響TRPCs和NF-κB表達(dá)，改善左心室的炎癥及纖維化。