王曉娟， 呂 品， 韓 梅

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北省醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，神經(jīng)與血管省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050017)

血管肥厚、硬化是高血壓所致心、腦、腎等并發(fā)癥的主要病理基礎(chǔ)［1］。循環(huán)血或局部產(chǎn)生的血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)可刺激中膜血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為細(xì)胞肥大或增殖，伴有細(xì)胞外基質(zhì)沉積和重構(gòu)，導(dǎo)致管壁增厚，順應(yīng)性降低，進(jìn)而引發(fā)高血壓［2］。平滑肌蛋白 22α(smooth muscle protein 22 alpha，SM22α)是VSMCs分化標(biāo)志物之一，除參與平滑肌收縮和細(xì)胞骨架重構(gòu)外，在VSMCs增殖、血管炎癥及氧化應(yīng)激過(guò)程中也發(fā)揮重要作用［3-6］。但其在Ang II誘導(dǎo)的血管硬化中的作用尚不明確。Ang II是已知最強(qiáng)的縮血管活性物質(zhì)之一，本實(shí)驗(yàn)利用Ang II微滲透泵皮下植入，建立大鼠高血壓模型。分別用含有野生型和突變型SM22α的重組腺病毒感染大鼠頸總動(dòng)脈，觀察SM22α對(duì)血管肥厚和基質(zhì)重構(gòu)相關(guān)分子表達(dá)的影響。

材料和方法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)13～16周齡 SD雄性大鼠，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 主要試劑

兔抗SM22α多克隆抗體和兔抗綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz;兔抗血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1)多克隆抗體、兔抗細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)多克隆抗體、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)多克隆抗體和兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)多克隆抗體購(gòu)自Epitomics;免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司;AngⅡ購(gòu)自Sigma。

3 主要方法

3.1 GFP標(biāo)記的重組腺病毒構(gòu)建 采用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)(ViraPowerTMAdenoviral Expression System)構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體。首先利用PCR方法擴(kuò)增GFP-SM22α使其具備特定的CACC接頭，以連接、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒等方法克隆入載體pENTR/D-TOPO以獲得入門克隆，經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定正確后，用重組酶(LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix)進(jìn)行入門克隆與表達(dá)載體(pAd-CMV/V5-DEST)間的重組，以獲得表達(dá)克隆Ad-GFP-SM22α。鑒定后的重組表達(dá)載體，用限制性內(nèi)切酶PacⅠ線性化后感染293A包裝細(xì)胞得到重組腺病毒。同樣，將SM22α第181位Ser分別點(diǎn)突變?yōu)锳sp(D)和Ala(A)后，構(gòu)建SM22α強(qiáng)制磷酸化突變體Ad-GFP-S181D和SM22α非磷酸化突變體Ad-GFP-S181A的腺病毒表達(dá)載體。

3.2 動(dòng)物模型的制作 雄性13～16周齡SD大鼠，戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。沿頸部正中線切開(kāi)皮膚及皮下組織，充分暴露頸總動(dòng)脈。將含有5×1012pfu/L腺病毒的F127凝膠涂在頸總動(dòng)脈周圍，其中分別導(dǎo)入SM22α、S181D和S181A重組腺病毒，縫合皮膚。3 d后無(wú)菌條件下將含有Ang II的Alzet泵(Ang II釋放速度為 750μg·kg-1·d-1)植入大鼠皮下組織，對(duì)照組埋植僅灌注有生理鹽水的Alzet泵，縫合切口。術(shù)后給予正常飲食，2周后取出Alzet泵停止輸注Ang II，處死大鼠。

3.3 形態(tài)學(xué)分析 取頸總動(dòng)脈標(biāo)本0.5 cm置冷PBS中洗凈殘留血液，放入4%多聚甲醛中固定至少24 h，乙醇梯度脫水，低溫石蠟垂直定向包埋，5μm厚度切片，常規(guī)HE染色。并于光鏡下觀察、照相、進(jìn)行圖像學(xué)分析，計(jì)算中膜厚度。

3.4 免疫組織化學(xué)分析 標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片。免疫組化染色采用SP法:石蠟切片經(jīng)二甲苯及乙醇脫蠟至水。修復(fù)緩沖液 (1.8 mmol/L檸檬酸，8.2 mmol/L檸檬酸鈉)中浸泡，微波抗原修復(fù)20 min，自然冷卻。滴加3%過(guò)氧化氫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶影響。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加山羊血清室溫孵育15 min，進(jìn)行封閉。傾去血清，滴加適當(dāng)比例稀釋的Ⅰ抗，37℃ 孵育過(guò)夜。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，37℃ 孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃ 孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。DAB顯色，鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒后用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。鏡下觀察相關(guān)抗原的表達(dá)變化。采用Image-Pro Morphometric圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行相對(duì)定量分析，掃描灰度值用積分吸光度(integral absorbance，IA)表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AngⅡ誘導(dǎo)大鼠血壓升高

在給予AngⅡ3 d后血壓明顯升高，至13 d時(shí)血壓升高至(181.8 ±7.1)mmHg，3 d、6 d、13 d與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.01)，提示高血壓模型復(fù)制成功;頸總動(dòng)脈感染各種重組腺病毒后血壓沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)表1。

2 頸總動(dòng)脈重組腺病毒感染成功

首先利用 PCR方法擴(kuò)增 GFP-SM22α、GFPS181D和GFP-S181A，見(jiàn)圖2;測(cè)序鑒定正確后，采用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒。大鼠頸總動(dòng)脈感染以上腺病毒后，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行GFP免疫組織化學(xué)染色，見(jiàn)圖3。感染血管壁細(xì)胞中均有GFP陽(yáng)性顆粒，表明腺病毒感染的血管可穩(wěn)定表達(dá)外源基因。

表1 植泵前后大鼠收縮壓測(cè)量結(jié)果Table 1.Systolic blood pressure with vehicle or Ang II treatment(mmHg.Mean±SD.n=3)

Figure 2.The GFP-SM22α，GFP-S181D and GFP-S181A were amplified by PCR.圖2 PCR方法擴(kuò)增 GFP-SM22α、GFP-S181D和 GFPS181A

3 SM22α及其非磷酸化突變體抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管中膜肥厚

高血壓模型組 Ad-GFP(+)、Ad-GFP-SM22α(+)、Ad-GFP-S181D(+)和 Ad-GFP-S181A(+)與對(duì)照組 Ad-GFP(-)相比中膜厚度分別增加了39.56%、13.00%、43.94%和14.55%。其中 Ad-GFP(+)和Ad-GFP-S181D(+)與對(duì)照組比差異顯著(P ＜0.01)，Ad-GFP-SM22α(+)和 Ad-GFPS181A(+)組與對(duì)照組比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Ad-GFP-SM22α(+)和 Ad-GFP-S181A(+)與 Ad-GFP(+)組比中膜厚度分別減少了19.04%和17.93%，差異顯著(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)SM22α及其非磷酸化突變體可抑制血管肥厚，而SM22α磷酸化則無(wú)此作用，見(jiàn)圖4。

Figure 3.Representative immunohistochemical staining for GFP of carotid artery sections from different groups(×400).圖3 GFP蛋白在各組血管壁的表達(dá)情況

Figure 4.Vascular hypertrophy in rats with HE staining.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P ＜0.05 vs Ad-GFP(+).圖4 各組大鼠血管HE染色顯示血管壁肥厚情況

4 SM22α及其非磷酸化突變體抑制AngⅡ誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常頸總動(dòng)脈壁細(xì)胞中僅有MMP-2和MMP-9的少量表達(dá);高血壓模型組感染 Ad-GFP(+)、Ad-GFP-SM22α(+)、Ad-GFP-S181D(+)和Ad-GFP-S181A(+)分別與正常對(duì)照組Ad-GFP(-)比，MMP-2/MMP-9蛋白表達(dá)量則分別增加了463.0%/430.0%、34.8%/65.1%、413.0%/460.4%和15.2%/70.2%，其中Ad-GFPS181D(+)和Ad-GFP(+)組與對(duì)照組比有顯著差異(P＜0.01)，而過(guò)表達(dá)SM22α和非磷酸化突變體S181A組與正常對(duì)照組比無(wú)顯著差異(P＞0.05);感染 Ad-GFP-S181A(+)和 Ad-GFP-SM22α(+)與 Ad-GFP(+)相比，MMP-2/MMP-9表達(dá)量分別減少了76.1%/68.9%和79.5%/67.9%，差異顯著(P＜0.05);而 Ad-GFP-S181D(+)與其比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖 5、6。上述結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)SM22α及其非磷酸化突變體抑制MMP-2/MMP-9的表達(dá)，而SM22α磷酸化則促進(jìn)其表達(dá)。

5 SM22α及其非磷酸化突變體抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)

免疫組化染色顯示，正常血管壁細(xì)胞中有少量的ICAM-1和VCAM-1的表達(dá);而在高血壓模型血管壁中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)升高，Ad-GFP(+)、Ad-GFP-SM22α(+)和Ad-GFP-S181D(+)與正常對(duì)照組Ad-GFP(-)比，ICAM-1/VCAM-1蛋白表達(dá)量分別增加了 262.5%/315.4%、20.8%/7.7%和291.6%/342.3%，而 Ad-GFP-S181A(+)組無(wú)明顯變化，其中Ad-GFP-S181D(+)和Ad-GFP(+)組與對(duì)照組比有顯著差異(P＜0.01)，而過(guò)表達(dá)SM22α和非磷酸化突變體S181A組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05);Ad-GFP-S181A(+)和 Ad-GFP-SM22α(+)與Ad-GFP(+)比，ICAM-1/VCAM-1表達(dá)量分別減少了64.4%/74.1%、72.2%/72.2%，差異顯著(P＜0.05)，而Ad-GFP-S181D(+)與其比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖7、8。上述結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)SM22α及其非磷酸化突變體抑制ICAM-1與VCAM-1表達(dá)。

Figure 5.Immunohistochemical staining for MMP-2 of carotid artery sections(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P＜0.05 vs Ad-GFP(+).圖5 MMP-2蛋白在各組大鼠血管壁的表達(dá)

討 論

高血壓導(dǎo)致的動(dòng)脈重塑主要病理表現(xiàn)為血管壁中層平滑肌細(xì)胞增生和肥大，基質(zhì)沉積，血管僵硬，管腔狹窄。本研究用皮下植入含有Ang II的微滲透泵成功制作高血壓模型［8］，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)頸總動(dòng)脈局部感染SM22α及其S181位點(diǎn)突變體的重組腺病毒，觀察過(guò)表達(dá)外源SM22α及其突變體對(duì)高血壓血管肥厚的抑制作用。結(jié)果顯示，SM22α野生型和S181A非磷酸化突變體可有效抑制感染的頸總動(dòng)脈的血管肥厚和細(xì)胞遷移相關(guān)分子MMP-2/MMP-9和黏附分子VCAM-1/ICAM-1的表達(dá)。

Ang II是血管緊張素中最重要的組成部分。人體的血管平滑肌上存在有血管緊張素受體，Ang II與其受體結(jié)合引起全身微動(dòng)脈收縮，動(dòng)脈壓升高［9］。本實(shí)驗(yàn)利用Ang II微滲透泵皮下植入，誘導(dǎo)大鼠血壓升高。并對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)血管壁明顯增厚，成功復(fù)制了高血壓血管肥厚模型。

VSMCs是血管中膜的主要細(xì)胞成份，其表型轉(zhuǎn)化在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及血管成型術(shù)后再狹窄等病理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用［10］。SM22α是一種重要的VSMCs的分化標(biāo)志基因，具有組織特異性，僅在平滑肌組織中特異性表達(dá)［4-5］。研究證明，SM22α 在 VSMCs的增殖［3］、遷移、血管炎癥［4］及血管氧化應(yīng)激［6］等方面中起重要作用［11-14］。本研究利用本室構(gòu)建的Ad-GFP-SM22α、Ad-GFP-S181A和Ad-GFP-S181D腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)，感染大鼠頸總動(dòng)脈觀察過(guò)表達(dá)外源SM22α及其突變體對(duì)血管肥厚和重構(gòu)相關(guān)分子表達(dá)的影響。

細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)是血管損傷與修復(fù)的病理基礎(chǔ)。MMP是降解VSMCs基底膜基質(zhì)的主要酶類，參與血管基質(zhì)的重構(gòu)。其中MMP-2［15］和MMP-9是研究最多的與動(dòng)脈粥樣硬有關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶。因此我們可以通過(guò)檢測(cè)血管中膜MMP-2和MMP-9［7］表達(dá)量的變化來(lái)確定細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的狀態(tài)。本研究利用免疫組化的方法檢測(cè)肥厚血管壁中MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量比對(duì)照組明顯增高，該結(jié)果與前期資料顯示一致［15］;過(guò)表達(dá)外源SM22α及其非磷酸化突變體可下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)，而SM22α磷酸化則促進(jìn)其表達(dá)，提示穩(wěn)定表達(dá)的SM22α具有抑制血管基質(zhì)重構(gòu)的作用。

研究表明，Ang II與VSMCs上AT1受體結(jié)合后，可經(jīng)多條信號(hào)通路，啟動(dòng)VSMCs表型轉(zhuǎn)化，增殖狀態(tài)的VSMCs合成分泌大量的細(xì)胞黏附分子，其中包括ICAM-1和VCAM-1，其表達(dá)量的增多是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和血管重塑的始動(dòng)環(huán)節(jié)［16-17］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察在肥厚血管壁中ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)情況。免疫組化染色顯示:肥厚血管壁中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增高，而過(guò)表達(dá)外源SM22α及其非磷酸化突變體則抑制ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，SM22α磷酸化促進(jìn)其表達(dá)。該結(jié)果進(jìn)一步佐證了SM22α抑制血管重塑的作用。

Figure 6.Immunohistochemical staining for MMP-9 of carotid artery sections(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P＜0.05 vs Ad-GFP(+).圖6 MMP-9蛋白在各組大鼠血管壁的表達(dá)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠高血壓模型作為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)外源SM22α及其非磷酸化突變體可顯著抑制血管肥厚，與抑制基質(zhì)重構(gòu)相關(guān)分子 MMP-2、MMP-9和黏附分子ICAM-1、VCAM-1表達(dá)有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)可為高血壓的防治提供新的理論依據(jù)，為血管損傷性疾病的治療提供新的藥物篩選靶點(diǎn)。

Figure 7.Immunohistochemical staining for ICAM-1 of carotid artery sections(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P＜0.05 vs Ad-GFP(+).圖7 ICAM-1蛋白在各組大鼠血管壁的表達(dá)情況

Figure 8.Immunohistochemical staining for VCAM-1 of carotid artery sections(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P＜0.05 vs Ad-GFP(+).
圖8 VCAM-1蛋白在各組大鼠血管壁的表達(dá)情況

［7］ Nair RR，Solway J，Boyd DD.Expression cloning identifies transgelin(SM22)as a novel repressor of 92-kDa type IV collagenase(MMP-9)expression［J］.J Biol Chem，2006，281(36):26424-26436.

［8］ Dzau VJ.Tissue angiotensin and pathobiology of vascular disease:a unifying hypothesis［J］.Hypertension，2001，37(4):1047-1052.

［9］ Ruiz-Ortega M，Lorenzo O，Ruperez M，et al.Role of the renin-angiotensin system in vascular diseases:expanding the field［J］.Hypertension，2001，38(6):1382-1387.

［10］ Fuster JJ，F(xiàn)ernandez P，Gonzalez-Navarro H，et al.Control of cell proliferation in atherosclerosis:insights from animal models and human studies［J］.Cardiovasc Res，2010，86(2):254-264.

［11］ Kutuk O，Basaga H.Inflammation meets oxidation:NF-κB as a mediator of initial lesion development in atherosclerosis［J］.Trends Mol Med，2003，9(12):549-557.［12］ Savoia C，Schiffrin EL.Vascular inflammation in hyper

tension and diabetes:Molecular mechanisms and therapeutic interventions［J］.Clin Sci(Lond)，2007，112(7):375-384.

［13］ Hansson GK.Inflammation，atherosclerosis，and coronary artery disease［J］.N Engl J Med，2005，352(16):1685-1695.

［14］Han M，Dong LH，Zheng B，et al.Smooth muscle 22 alpha maintains the differentiated phenotype of vascular smooth muscle cells by inducing filamentous actin bundling［J］.Life Sci，2009，84(13-14):394-401.

［15］韓 梅，溫進(jìn)坤.細(xì)胞因子對(duì)血管平滑肌細(xì)胞MMP-2基因表達(dá)的誘導(dǎo)及其作用機(jī)制［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2000，16(2):249-253.

［16］ Mehta PK，Griendling KK.Angiotensin II cell signaling:physiological and pathological effects in the cardiovascular system［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(1):C82-C97.

［17］ Shen J，Yang M，Ju D，et al.Disruption of SM22 promotes inflammation after artery injury via nuclear factorκB activation［J］.Circ Res，2010，106(8):1351-1362.