楊志英，鄧志剛，伍健明，藍(lán)偉紅，張茂祥

在癌癥和飲食的相關(guān)性越來(lái)越強(qiáng)的今天，天然抗癌食物倍受重視，芹菜素作為食物提取物也被人們廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)外試驗(yàn)研究表明，芹菜素具有廣譜的抗瘤性[1]，包括前列腺癌[2]、乳腺癌[3]、肺癌[4]、宮頸癌[5]、結(jié)腸癌[6]等，然而目前芹菜素對(duì)中樞神經(jīng)腫瘤——膠質(zhì)瘤是否具有抑制作用，卻鮮見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道。本研究旨在通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討芹菜素是否對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及p21、p53 表達(dá)有影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251 購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。

1.1.2 主要試劑 芹菜素購(gòu)于美國(guó) Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó) Amresco公司；苯甲基硫酰氟（PMSF）購(gòu)于美國(guó) Promega公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)（MTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）購(gòu)于Gibco公司；鼠單克隆抗人 p21和p53 抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配置 膠質(zhì)瘤 U251 細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，RPMI 1640 培養(yǎng)液常規(guī)傳代，取其生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。100% DMSO 溶解芹菜素，配制成 40 mmol/L的濃縮液，于–20 ℃貯存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)加入完全培養(yǎng)基以配制濃度分別為20、40、80 μmol/L的芹菜素工作液，以完全培養(yǎng)基為對(duì)照組。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)芹菜素對(duì) U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率 消化液消化 U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以全培養(yǎng)液終止并調(diào)整細(xì)胞密度至 1×105個(gè)/L，接種于96 孔板，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。吸去舊培養(yǎng)液，加入終濃度為0（對(duì)照組）、20、40、80 μmol/L的芹菜素工作液，分別培養(yǎng) 24、48及72 h。加入新鮮配制的MTT，培養(yǎng) 4 h，取出，棄上清，加入 DMSO，置于搖床振蕩 10 min，至顆粒完全溶解后，于酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值（A 值），測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。每組設(shè) 5個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。計(jì)算細(xì)胞抑制率，公式為：細(xì)胞抑制率（%）=（A對(duì)照組－A處理組）/A對(duì)照組×100%。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)芹菜素對(duì) U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞 p21和p53蛋白表達(dá)的影響 U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別用不同濃度(0、20、40、80 μmol/L)的芹菜素工作液處理 48 h，收集細(xì)胞，3000 r/min 離心10 min 后，冰 PBS 沖洗，加入細(xì)胞裂解液，于冰上裂解 1 h 后，13000 r/min 離心 10 min，收集上清。測(cè)定蛋白含量采用 Folin-酚試劑法。加入上樣緩沖液后加熱使其變性，凝膠電泳以分離蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)移蛋白帶至 PVDF 膜上，封閉液封閉蛋白結(jié)合位點(diǎn) 2 h。加入 p53、p21 一抗(按 1∶1000 倍稀釋)，4 ℃ 孵育過(guò)夜。加相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(按 1∶2000 倍稀釋)，室溫孵育 1 h。以ECL 顯色系統(tǒng)顯色。采用 WO-9413B 型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件 Gelpro 32 分析膠片中的蛋白條帶，以各組灰度面積的乘積/內(nèi)參照（β-actin）灰度面積的乘積反映相對(duì)蛋白表達(dá)豐度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

20 μmol/L的芹菜素抑制膠質(zhì)瘤 U251 細(xì)胞增殖的作用不明顯（P ＞0.05），24、48、72 h的抑制率分別為3.07%±0.13%、3.98%±0.15%、4.86%±0.21%。而 40 μmol/L 及80 μmol/L的芹菜素抑制膠質(zhì)瘤 U251 細(xì)胞增殖（P＜0.05），其 24、48、72 h的抑制率分別為19.12%±0.22%、28.79%±0.18%、36.53%±0.19% 及37.41%±0.16%、45.86%±0.23%、54.25%±0.24%，呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，見(jiàn)圖 1。

圖1 不同濃度芹菜素對(duì) U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響Figure1 Effect of apigenin with various concentrations on proliferation of glioma cell line U251

2.2 芹菜素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 p53和p21 表達(dá)的影響

Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，芹菜素可以上調(diào) U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 p53和p21蛋白的表達(dá)，且隨著芹菜素濃度的增加，蛋白表達(dá)逐漸增加，結(jié)果見(jiàn)圖 2及圖 3。

圖2 不同濃度芹菜素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 p53和p21蛋白表達(dá)的影響Figure2 Effect of apigenin with various concentrations on p21, p53 protein expression in glioma cell line U251

圖3 不同濃度芹菜素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 p53和p21蛋白表達(dá)的影響Figure3 Effect of apigenin with various concentrations on p21, p53 protein expression in glioma cell line U251

3 討論

膠質(zhì)瘤是居中樞神經(jīng)系統(tǒng)首位的惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的40% 以上，其特點(diǎn)是發(fā)病率高，早期診斷難，治愈率低，易復(fù)發(fā)及易死亡[7]。目前臨床膠質(zhì)瘤常規(guī)是采用顯微手術(shù)切除、放療和化療為一體的治療方案[7]。對(duì)于膠質(zhì)瘤患者，尤其是高度惡性的患者，化療在治療中的重要性是明確并肯定的。然而，膠質(zhì)瘤的不均質(zhì)性，致使其對(duì)傳統(tǒng)化療藥物不敏感，導(dǎo)致整體治療效果不理想，并且毒副作用明顯，患者耐受性差，預(yù)后也不理想。因此，尋找治療膠質(zhì)瘤新藥，設(shè)計(jì)新的膠質(zhì)瘤化療方案具有重要的臨床意義。

芹菜素，也稱為芹黃素、洋芹素、芹菜配基等，是一種廣泛存在于多種食用植物中的黃酮類化合物，其中以芹菜根的含量最為豐富。化學(xué)結(jié)構(gòu)上3個(gè)烴基以及C2=C3雙鍵的存在，使之擁有相對(duì)獨(dú)特的藥理學(xué)效應(yīng)和生物學(xué)特性。其具有多種生物活性[8]，如抗病毒、抗炎癥、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、抗焦慮、保護(hù)心血管、保護(hù)中樞神經(jīng)等，其中以抗腫瘤作用最為人關(guān)注。

正常細(xì)胞的增殖取決于癌基因和抑癌基因的平衡調(diào)節(jié)。p53和p21是目前關(guān)注較多的抑癌基因。p53 表達(dá)產(chǎn)物 p53蛋白為基因調(diào)節(jié)蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。倘若 p53 基因發(fā)生突變，p53蛋白失活，細(xì)胞分裂也將失去節(jié)制，造成細(xì)胞惡變[9]。反之，如果 p53 基因穩(wěn)定，p53蛋白表達(dá)水平升高，則能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期停滯甚至細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。而 p21 基因編碼的p21蛋白為核內(nèi)蛋白，同樣對(duì)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化具有重要作用。p21蛋白水平的異常直接影響細(xì)胞的發(fā)展方向，也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系[11]。相關(guān)研究表明，芹菜素在體外能夠顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)前已知的作用機(jī)制主要圍繞以下三個(gè)方面：細(xì)胞周期阻滯[2-3]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-6]及抑制腫瘤血管的生成[12]。本研究結(jié)果顯示，芹菜素在體外呈劑量及時(shí)間依賴性地抑制膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖，并能上調(diào) U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中p53和p21蛋白的表達(dá)，且作用呈濃度依賴性。根據(jù)上述研究結(jié)果，我們推測(cè)，芹菜素可能通過(guò)激活 p53 途徑，增加 p53的穩(wěn)定性，使 U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi) p53和p21蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)而誘導(dǎo) U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯，將細(xì)胞周期阻滯在某一時(shí)期，并通過(guò) p53 途徑誘導(dǎo) U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)。Freitas等[12]近期的研究表明，芹菜素減少 GL15人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 VEGF 及TGF-β1的含量，而作為已確認(rèn)具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管形成作用并已上市的重組人單克隆抗體貝伐單抗，在此研究中，僅僅減少了 VEGF的含量。至于芹菜素更進(jìn)一步的作用機(jī)制，該研究并未涉及。其是否通過(guò)本研究中的p53途徑？芹菜素在活體研究中效果如何？這些問(wèn)題都值得我們進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果為芹菜素用于治療膠質(zhì)瘤提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，提示其可能為有效的膠質(zhì)瘤化療新藥之一。而作為食源性提取物，芹菜素用作腫瘤臨床化療方案，與傳統(tǒng)化療藥物相比，具有較可靠的藥物安全性、較好的耐受性及較輕的毒副作用，是天然抗腫瘤藥物，前景廣闊，相信對(duì)其深度的藥物研發(fā)，將進(jìn)一步提高膠質(zhì)瘤患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。

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