王麗嬋，馬霄，張華捷，譚亞軍，徐穎華，張庶民，侯啟明

金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種外毒素，為水溶性的蛋白質(zhì)，可引起食物中毒，由于其免疫激活作用極其強大，White等[1]將其定義為超抗原。超抗原與普通異種抗原不同，它不需要經(jīng)過抗原遞呈細胞（APC）的處理，在主要組織相容性復(fù)合體（MHC）II 類分子的作用下，只需極小劑量（10-12mol/L）就可以刺激比普通抗原多數(shù)千倍的Vβ 特異性 T 細胞增殖，并釋放大量細胞因子，是一種較好的免疫調(diào)節(jié)劑和增效劑[2-3]。根據(jù)血清型的不同將金黃色葡萄球菌的腸毒素主要分為SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE 七種類型，其中 SEA是最常見的一種[4]。

凡能非特異地通過物理或化學(xué)的方式與抗原結(jié)合或混合，并增強抗原免疫反應(yīng)性（包括細胞免疫或體液免疫）的物質(zhì)均可稱之為佐劑。目前常用的佐劑有鋁佐劑、蛋白類佐劑、含脂類佐劑及核酸類佐劑等，其中臨床應(yīng)用最多、最成熟的是鋁佐劑。本文的主要目的是初步探討重組超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素 A 作為免疫佐劑功能的可行性。如前所述，多項研究已經(jīng)表明[5-6]，SEA只需極小劑量即可激活大量 T 細胞，并釋放多種細胞因子，刺激 T 細胞的活性，提高機體免疫水平，特別是細胞免疫水平，這些特性使其具備作為免疫佐劑的潛力。本實驗室在前期超抗原抗腫瘤研究中已經(jīng)證實，金黃色葡萄球菌腸毒素能夠激發(fā)機體的細胞免疫反應(yīng)，誘導(dǎo) Th1 型細胞因子的產(chǎn)生[7]。本次研究主要是觀察其誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的能力，用 SEA與破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）和Al(OH)3佐劑聯(lián)合免疫小鼠，檢測小鼠的體液免疫效果，初步探討 SEA的佐劑效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及佐劑 破傷風(fēng)類毒素由華蘭生物工程股份有限公司提供；重組SEA 由本科室前期制備；Al(OH)3佐劑由北京天壇生物制品股份有限公司提供。

1.1.2 實驗動物 SPF 級 NIH 小鼠 64只，14～16 g，雌雄各半，購自本院實驗動物中心。飼養(yǎng)于SPF 級動物房。

1.1.3 主要試劑與儀器 HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 為美國 Santa Cruz公司產(chǎn)品；ELISA 酶標(biāo)板為美國 Costar公司產(chǎn)品；OPD 顯色試劑為美國Ameresco公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國 Molecμlar Devices公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及免疫 NIH 小鼠 64只，隨機分成 8組，每組8只，腹部皮下免疫 0.5ml/只。實驗分為兩個大組，分別是破傷風(fēng)類毒素高劑量組（1 lf/ml）和破傷風(fēng)類毒素低劑量組（0.25 lf/ml）；兩個劑量的TT 分別與高（80μg/ml）、中（20μg/ml）、低（5μg/ml）3個劑量的超抗原 SEA結(jié)合，以便確定 SEA的最適劑量；各個組均與終濃度為1.5 mg/ml的Al(OH)3佐劑 4 ℃ 吸附過夜。

1.2.2 小鼠血清抗體 IgG 水平檢測 動物免疫4周后，摘眼球采血，分離血清待用。利用破傷風(fēng)類毒素包被，3 lf/ml，每孔 100 μl，測定免疫后小鼠血清破傷風(fēng)類毒素抗體 IgG 水平。將各組小鼠免疫血清以 1∶100 起進行 2 倍倍比 8個系列稀釋，標(biāo)準(zhǔn)孔以百白破聯(lián)合疫苗免疫小鼠后4周血清作為對照，以 1∶400 起進行 2 倍倍比 8個系列稀釋，加入已包被抗原的酶標(biāo)板中，置37 ℃ 溫育 1 h。洗板后，加入 HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG，37 ℃ 溫育 1 h；洗板后，每孔加入顯色液 100 μl，室溫放置15 min；加入 2 mol/L 終止液，于30 min內(nèi)測定在波長 490 nm 處的各孔 A 值。將標(biāo)準(zhǔn)對照所含的破傷風(fēng)類毒素抗體含量設(shè)置為1，用SoftMax pro 軟件，應(yīng)用四參數(shù)、雙平行線分析方法對各樣品組的結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，計算抗體的酶標(biāo)單位數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 IBM SPSS Statistics 統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進行分析，實驗數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TT 高劑量組小鼠血清抗體 IgG 檢測結(jié)果

TT 高劑量免疫組，主要檢測在TT 及Al(OH)3免疫劑量不變的條件下，不同濃度的重組超抗原 SEA 對 TT的免疫增強作用。ELISA 法檢測免疫后4周的小鼠血清抗 TT 抗體水平，檢測結(jié)果見表1。

由檢測結(jié)果可見，與對照組相比，SEA 高劑量組及中劑量組均能顯著增強 TT的免疫原性（P＜0.05），且兩個劑量之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞0.05）；但 SEA 低劑量組未能增強 TT 免疫原性，與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞0.05）。

表1 TT 高劑量組免疫后小鼠血清抗 TT 抗體IgG 檢測（ ，n=8）Table1 Anti-TT IgG levels of immunized mice after immunization with high doses of TT groups ( , n=8)

表1 TT 高劑量組免疫后小鼠血清抗 TT 抗體IgG 檢測（ ，n=8）Table1 Anti-TT IgG levels of immunized mice after immunization with high doses of TT groups ( , n=8)

注：*和對照組比較，P＜0.05。Note: *Compared with control group, P＜0.05.

對照組 Control group 0.906±0.572 /SEA 高劑量組 SEA high dose 1.979±0.598* 0.001 SEA 中劑量組 SEA middle dose 1.734±0.725* 0.006 SEA 低劑量組 SEA low dose 0.708±0.207 0.49

表2 TT 低劑量組免疫后小鼠血清抗 TT 抗體IgG 檢測（ ，n=8）Table2 Anti-TT IgG levels of immunized mice after immunization with low doses of TT groups ( , n=8)

表2 TT 低劑量組免疫后小鼠血清抗 TT 抗體IgG 檢測（ ，n=8）Table2 Anti-TT IgG levels of immunized mice after immunization with low doses of TT groups ( , n=8)

注：*和對照組比較，P＜0.05。Note: *Compared with control group, P＜0.05.

抗 TT 抗體水平Anti-TT IgG levels P 值P value對照組 Control group 0.092±0.115 /SEA 高劑量組 SEA high dose 0.484±0.199* 0.002 SEA 中劑量組 SEA middle dose 0.425±0.327* 0.005 SEA 低劑量組 SEA low dose 0.618±0.171* 0.001

2.2 TT 低劑量組小鼠血清抗體 IgG 檢測結(jié)果

TT 低劑量免疫組，檢測在TT 及Al(OH)3免疫劑量不變的條件下，不同濃度的SEA 對低劑量TT的免疫增強作用。檢測方法同上，檢測結(jié)果見表2。

與對照組相比，SEA的各個劑量組均能增強低劑量 TT的免疫原性，P＜0.05；且各個劑量組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。

結(jié)合以上兩個劑量 TT的免疫結(jié)果，可得出如下結(jié)論：①無論是對照組還是樣品組，高劑量 TT免疫組產(chǎn)生的抗體水平均高于低劑量免疫組；②對于不同劑量 SEA的免疫增強作用，在TT 高劑量組，高、中劑量的SEA 免疫協(xié)同增強作用相同，低劑量 SEA 與對照組相比未能增強 TT 免疫原性；③ TT 低劑量免疫組，3 種不同劑量的SEA 均能協(xié)同增強 TT的免疫原性，且各劑量之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異；④從試驗結(jié)果可看出，按照免疫佐劑用量最小化原則，SEA 協(xié)同增強 TT 免疫原性的最適劑量為20μg/ml，無論是高劑量 TT組，還是低劑量 TT組，均能增強其免疫原性。

3 討論

金黃色葡萄球菌腸毒素 A 作為一類高效免疫刺激分子，與MHC-II 類分子和TCR 具有獨特的作用方式，組成三聚體復(fù)合物，進而誘導(dǎo) T 細胞的大量增殖和細胞因子的釋放，活化 Th1 型細胞等效應(yīng)，提高機體免疫水平，尤其是細胞免疫水平。SEA 這些特性使其在腫瘤生物學(xué)治療方面的應(yīng)用日益廣泛，受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注，可單獨應(yīng)用[8]，也可與其他載體聯(lián)用制備融合蛋白發(fā)揮抑瘤作用[9-11]。近來，利用超抗原特性作為免疫佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑的研究也有所報道[12-13]。本實驗室在之前的研究中證實了此類超抗原激活細胞免疫及其抗腫瘤效果[7]，在本次實驗中主要是觀察重組SEA與TT 聯(lián)合免疫后對 TT的體液免疫增強作用。

為了確定重組SEA的最適使用劑量，實驗中將 TT 分高劑量組和低劑量組，每個劑量組又分別與高、中、低 3個劑量的SEA 同時與Al(OH)3吸附后免疫小鼠。體液免疫檢測結(jié)果顯示，在TT 高劑量組，高、中劑量的SEA 均能顯著增強 TT的抗體水平，而低劑量 SEA組的檢測結(jié)果在數(shù)值上卻略低于對照組，但這并不能說明低劑量的SEA會干擾甚至降低 TT的免疫原性，因為兩者經(jīng)統(tǒng)計分析后并沒有統(tǒng)計學(xué)差異。造成此種現(xiàn)象的潛在原因如下：首先是實驗動物本身的個體差異較大，致使對同一抗原的免疫反應(yīng)差異；其次是實驗操作者在實驗過程中可能存在誤差，比如動物免疫、ELISA測定等環(huán)節(jié)。在實驗條件允許的情況下，可通過加大樣本量來減少或消除造成這些誤差的潛在因素。在TT 低劑量組，高、中、低劑量的SEA 均能增強 TT的免疫原性，且各劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，但與對照組[Al(OH)3+ TT]相比均有統(tǒng)計學(xué)差異。以上這些結(jié)果說明對于TT 抗原來說，SEA的最適使用劑量與TT的濃度有關(guān)，TT 免疫劑量越低，SEA 對其免疫增強作用越明顯，且達到同樣的免疫增強效果的同時所需 SEA 劑量越小。但綜合兩個 TT 免疫劑量的實驗結(jié)果來看，在SEA 濃度為20μg/ml，即小鼠免疫劑量為10 μg/只時，對高劑量 TT和低劑量 TT 均有較強的協(xié)同免疫增強作用，因此對 TT 來說，SEA的最適劑量為20μg/ml。本實驗中只研究了重組SEA 對 TT 抗原的免疫增強作用與免疫劑量之間的關(guān)系，但是，對 TT 免疫增強作用的最適劑量并不一定適合其他種類的抗原，因此，SEA的使用劑量還需依抗原而定。

理論上，試驗中應(yīng)該在不同時間點取血檢測抗體產(chǎn)生的動態(tài)水平，這樣可以更全面地監(jiān)測免疫后產(chǎn)生抗體高峰期的時間。但本研究只是對 SEA 協(xié)同增強 TT的免疫原性在抗體水平上進行初步評價，想通過增加 SEA 成分，在不影響或增加 TT保護力的同時，減少 TT的使用量。加之根據(jù)《中國藥典》[14]規(guī)定，破傷風(fēng)疫苗效力檢測在疫苗免疫后4周進行毒素攻擊，計算其保護性，因此本研究選擇了免疫 4周后進行免疫效果觀察。此外，本試驗結(jié)果顯示 TT 抗體水平在SEA的協(xié)同下顯著提高。但是，是否增高的TT 抗體水平能夠提高其保護性，還需要在后續(xù)實驗中建立破傷風(fēng)毒素攻擊的動物模型進行更全面的評價。

綜上所述，重組SEA和Al(OH)3佐劑聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高 TT 對小鼠的體液免疫效果，增強TT的免疫原性，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有一定的協(xié)同效應(yīng)，初步證明了重組SEA 作為免疫佐劑使用的可行性，為后續(xù)超抗原佐劑的研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時也為其應(yīng)用提供了更廣闊的前景。

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