袁紅花，王珍珍，陳仁金，胡安康，張騰業(yè)，吳連連，冀德君，朱孝榮*

(1.徐州醫(yī)學(xué)院， 江蘇 徐州 221004；2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009)

牛皮蠅蛆病是由牛皮蠅寄生于牦?；螯S牛體內(nèi)引起的一種家畜寄生蟲病，牛只感染后可使產(chǎn)奶量和產(chǎn)肉量降低，牛皮穿孔，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，紋皮蠅和牛皮蠅幼蟲能在宿主組織中移行8個月，其分泌的四種絲氨酸蛋白酶―皮蠅素，起免疫抑制作用，以致宿主不能用免疫機(jī)能殺死蠅的幼蟲。皮蠅素A(Hydermin A，HA)是牛皮蠅一期幼蟲在宿主體內(nèi)游行時分泌的一種絲氨酸蛋白酶。皮蠅素A具有抗炎、抑制補(bǔ)體反應(yīng)等功能[1-2]。

據(jù)研究報(bào)道，HA調(diào)節(jié)宿主免疫功能有下列3種機(jī)制： HA抑制IL-10生成，從而抑制T-淋巴細(xì)胞增殖[3]；裂解補(bǔ)體C3，中斷宿主補(bǔ)體反應(yīng)途徑[4]；HA通過前列腺素途徑，過表達(dá)前列腺素E2，減少IL-2生成，抑制免疫排斥[5]。HA這些免疫調(diào)節(jié)功能，抑制了宿主對牛皮蠅幼蟲的排斥反應(yīng)，保證了牛皮蠅幼蟲在宿主體內(nèi)成活。HA具有很好的免疫原性，以其作為免疫抗原，可使被免疫的動物產(chǎn)生對牛皮蠅幼蟲感染具有保護(hù)性的抗體。利用生物學(xué)信息預(yù)測HA蛋白的高級結(jié)構(gòu)及親水性，根據(jù)分析結(jié)果選取預(yù)測抗原性較高與已知蛋白同源性低的多肽片段，采用固相多肽合成法合成多肽，免疫家兔，制備HA的多克隆抗體。為進(jìn)一步研究HA的分子功能提供了有用的工具。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新西蘭大白兔為徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)；完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑購自購自Gibco BRL公司；載體蛋白交聯(lián)試劑盒購自Pharmacia Biotech公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑及BcA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司；HRP-IgG抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方 法

1.2.1 生物學(xué)分析及多肽的設(shè)計(jì) 登錄進(jìn)入http:// www.nicbi.nlm.nih.gov，采用Blastn和Blastx程序，進(jìn)行同源性和保守性分析。利用生物信息學(xué)DNAstar (Protean)軟件對HA的二級結(jié)構(gòu)、抗原性、親水性、疏水性、結(jié)合位點(diǎn)、氨基酸的帶電性及所選擇氨基酸偏堿性和偏酸性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析[6]。設(shè)計(jì)含13～16個氨基酸的目的多肽。

1.2.2 多肽的合成及載體的偶聯(lián) 多肽的合成和與載體蛋白-血藍(lán)素聯(lián)(KLH)接交由百奇生物有限公司完成，多肽的合成采用9-氟甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)moc)固相合成法合成多肽片段，利用高效液相法(highper formance liquid chromatography，HPLC)進(jìn)行純化，純化后的樣品再用質(zhì)譜分析，純度為91.2%。

1.2.3 抗HA多肽抗體的制備 以250 μg/次劑量的多肽-KLH偶聯(lián)物與等體積的完全弗氏佐劑混合，采用背部多點(diǎn)注射法。兩周后取多肽抗原原液加等體積的不完全弗氏佐劑進(jìn)行免疫，連續(xù)免疫3～4次，每次免疫10 d左右，從兔耳靜脈采血測定抗體效價(jià)，符合要求時，動脈取血，分離血清，-20 ℃保存。

1.2.4 ELISA檢測多克隆抗體的效價(jià) 人工合成裸肽作為抗原，以2 μg/mL為最終濃度溶解于包被液中，對應(yīng)孔加入100 μL抗原，室溫孵育2 h或4 ℃過夜；抗血清稀釋比分別為1∶1 k、1∶4 k、1∶8 k。以1∶1 k、1∶4 k，稀釋的正常兔血清作為陰性對照，37 ℃孵育1～2 h或室溫孵育3 h；每孔中加100 μL二抗，室溫孵育1 h，倒空并拍干殘留液體，加滿洗滌液清洗，重復(fù)2～5次；每孔中加入100 μL底物，顯色30 min，酶標(biāo)儀讀取405～410 nm波長處的OD值。

1.2.5 Western blotting 分析抗血清和多克隆抗體的特異性 提取牛皮蠅一期幼蟲的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，加心法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，半干轉(zhuǎn)40 mA，45 min，室溫封閉1～2 h。多克隆抗體的終濃度為4 μg/mL，陰性和陽性血清稀釋比為1∶1 500，4 ℃孵育過夜。HRP-標(biāo)記的羊抗兔的二抗采用1∶1 000稀釋，室溫孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光底物檢測。

2 結(jié) 果

2.1 采用生物學(xué)信息學(xué)預(yù)測多肽序列

對HA序列進(jìn)行抗原表性生物學(xué)信息分析(圖1)，采用Blastn和Blastx程序發(fā)現(xiàn)HA3段多肽序列具有良好的序列特異性，多肽序列如表1所示。

圖1 HA抗原性的生物學(xué)信息分析A.同源性；B.親水性；C.β-轉(zhuǎn)角；D.柔性區(qū)域；E.易近性Fig. 1 Analysis of antigenicity of HA biological informationA.Homology；B.Hydrophilic；C.β-corner；D.Flexible regions；E.Easy to be close

2.2 抗血清或多克隆抗體效價(jià)

采用間接ELSIA方法，對三只兔子的血清進(jìn)行免疫檢測，并取陰性兔子為對照。陽性血清分別稀釋為1∶1 k、1∶4 k和1∶8 k，陰性血清分別稀釋為：1∶1 k和1∶4 k。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1∶1 k的條件下，樣本A、B和C的兩個重復(fù)抗血清的OD值分別為3.481、3.459和3.424(表2)。對A和B的多克隆抗體進(jìn)行RP-HPLC純化，并通過質(zhì)譜鑒定，結(jié)果最終濃度分別達(dá)到1.14 mg/mL、1.17 mg/mL和0.96 mg/mL。

表1 多肽序列及其評分Table 1 Peptide sequences and scores

表2 血清的ELISA結(jié)果Table 2 The results of serum ELISA

2.3 Western印跡檢測HA抗體特異性

提取牛皮蠅一期幼蟲的總蛋白，分別加入一抗(2 μg/mL)，陰性血清(1∶1 500)和陽性血清(1∶1 500)。結(jié)果顯示一抗與陽性血清在28 kD處均有目標(biāo)條帶，說明HA 抗體的特異性較強(qiáng)(圖2)。

圖2 三種抗體的western印跡驗(yàn)證結(jié)果1，4，7分別為抗1、抗2、抗3；2，5，8分別為陰性血清；3，6，9分別為陽性血清Fig.2 Western blotting result of the three antibodies 1，4 and 7 are respectively antibody 1, 2 and 3; 2, 5 and 8 are negative serums, while 3, 6 and 9 are positive serums

3 討 論

HA 是一種功能性抗原基因，在特異性的免疫系統(tǒng)中參與免疫調(diào)節(jié)過程。研究發(fā)現(xiàn)，HA能降解補(bǔ)體C3 ,抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，從而延遲移植排斥反應(yīng)[7-8]?？贵w是研究蛋白必不可少的研究工具，根據(jù)氨基酸序列合成多肽并與載體偶聯(lián)，免疫制備多肽抗體是一種比較快速的手段。利用生物信息學(xué)對HA的抗原性及其親水性分析提示該氨基酸具有較好的抗原性，并發(fā)現(xiàn)抗原表位主要分布在氨基酸的C端，101～116,161～173,37～50的三個區(qū)域。

通過RP-HPLC方法測定人工合成的多肽發(fā)現(xiàn)，其純度達(dá)到91.2%，并通過質(zhì)譜鑒定分子量與預(yù)計(jì)的分子量吻合為28 kD。然后與KLH連接，免疫新西蘭大白兔，得到了HA的多肽抗體。采用ELISA和western blotting方法驗(yàn)證了抗體的特異性。ELISA結(jié)果顯示制備的HA多肽抗體特異性識別多肽，且滴度較高。同時從牛皮蠅一期幼蟲中提取蛋白，對制備抗體、陰性血清和陽性血清進(jìn)行western blotting檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備抗體和陽性血清分別在28 kD處有目的條帶，而陰性血清沒有目的條帶。

綜上所述，結(jié)果顯示制備的HA多克隆抗體具有與抗原結(jié)合的特異性，并運(yùn)用ELISA和western blotting方法進(jìn)行了驗(yàn)證。這為進(jìn)一步研究HA的分子功能及免疫調(diào)控機(jī)制提供了有用工具。

參考文獻(xiàn):

[1] Boulard C. Degradation of bovine C3 by serine proteases from parasites Hypoderma lineatam (diptera, oesttidae)[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2001, 20:287-391.

[2] Gjini E, Haydon D T, Barry J D,et al. Critical interplay between parasite differentiation, host immunity, and antigenic variation in trypanosome infections [J]. American Naturalist, 2010, 176(4): 424-439.

[3] Panadero R, Dacal V, López C, et al.Immunomodulatory effect of Hypoderma lineatum antigens: in vitro effect on bovine lymphocyte proliferation and cytokine production [J]. Parasite Immunology, 2009, 31: 72-77.

[4] Baron R W. Cleavage of purified bovine complement component C3 in larval Hypoderma lineatum (Diptera: Oestridae) hypo-dermins [J]. Journal of medical entomology, 1990, 27 (5): 899-904.

[5] Nicolas-Gaulard I, Moire N, Boulard C. Effect of the parasite enzyme, hypodermin A, on bovine lymphocyte proliferation and interleukin-2 production via the prostaglandin pathway [J]. Immunology, 1995, 85 (1): 160-165.

[6] 陳 卓，劉家駒，畢 亮，等. NPR1多肽抗體的制備和應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2012(1): 145-149.

[7] Malassagne B, Regimbeau J M, Taboit F, et al. Hypodermin A, a new inhibitor of human complement for the prevention of xenogeneic hyperacute rejection [J]. Xenotransplantation, 2003, 10: 267-277.

[8] Panadero R, Dacal V, Lopez C, et al. Immunomodulatory eff-ect of Hypoderma lineatum antigens: in vitro effect on bovine lymphocyte proliferation and cytokine production [J]. Parasite Immunology, 2009, 31: 72-77.